裸仁南瓜籽油活性成分分析及抗氧化能力评价
2018-12-12田戴思慧沈鹏原贺向荣钟晴刘东波
陈 田戴思慧沈鹏原贺向荣钟 晴刘东波,3,4
CHEN Tian1,2 DAI Si-hui1 SHEN Peng-yuan1,2 HE Xiang-rong1 ZHONG Qing1 LIU Dong-bo1,2,3,4
(1. 湖南农业大学园艺园林学院，湖南 长沙 410128；2. 国家中医药管理局亚健康干预技术实验室，湖南 长沙 410128；3. 湖南省作物种质创新与资源利用重点实验室，湖南 长沙 410128；4. 湖南省植物功能成分利用协同创新中心，湖南 长沙 410128)
(1. College of Horticulture and Landscape, Hunan Agricultural University, Changsha, Hunan 410128, China; 2. State Key Laboratory of Subhealth Intervention Technology, Changsha, Hunan 410128, China; 3. Hunan Provincial Key Laboratory of Crop Germplasm Innovation and Utilization, Changsha, Hunan 410128, China; 4. Hunan Coinnovation Center for Utilization of Botanical Functional Ingredients, Changsha, Hunan 410128, China)
南瓜[Cucurbitamoschata(Duch. Ex Lam.)Duch. Ex Poir]属葫芦科(Cucurbitaceae)南瓜属(Cucubita)一年生草本植物[1]，在中国种植范围广，资源丰富，品种繁多，其口感甜美细腻，且具有降血糖、降血压等功效[2]。南瓜籽是南瓜的成熟种子，其油脂含量丰富，经榨取或浸提即得南瓜籽油[3]。2017年10月27日国家粮食局颁布了LS/T 3250—2017《南瓜籽油》标准，南瓜籽油正式进入食用油行列。南瓜籽油含有丰富的不饱和脂肪酸、植物甾醇、角鲨烯、氨基酸、胡萝卜素、矿物质及多糖等营养成分[4]，具有降血糖[5]、抑制男性秃头[6]、杀虫[7]、治疗前列腺增生[8]等作用。
裸仁南瓜是南瓜的一种籽仁突变品种，在南瓜生长进化过程中，由籽仁木质素的降低和缺失使种皮的第 2～4细胞层坍塌[9]。由于没有坚硬的外壳，可以直接食用，在食品加工过程中省去了剥皮的步骤，节省了大量的成本，具有很高的推广价值[10]。已有学者对裸仁南瓜籽油的萃取工艺和营养价值进行研究，如李全宏[11]探索了超临界CO2流体萃取裸仁南瓜籽油的工艺，及其对油质量的影响。刘玉梅等[12]分析了裸仁南瓜籽的营养成分如粗脂肪、粗纤维、粗蛋白质、微量元素等的含量，及裸仁南瓜籽油的脂肪酸组成和含量，发现铁、锌、铜、锰显著高于普通南瓜籽。裸仁南瓜籽油脂肪酸含量高，主要包含以油酸和亚油酸为主的不饱和脂肪酸，其中亚油酸含量较花生油和菜籽油高。但目前对裸仁南瓜籽油其他活性成分，如植物甾醇、角鲨烯的组成及相对含量未见报道，其抗氧化功效研究也缺乏。
本研究根据LS/T 3250—2017《南瓜籽油》标准检测裸仁南瓜籽油，以香味纯正清郁、营养价值高、深受消费者青睐的葡萄籽油[13]和亚麻籽油[14]作为参照，采用GC-MS、HPLC分析比较裸仁南瓜籽油活性成分及其含量，并对裸仁南瓜籽油体外抗氧化活性进行评价，旨在为裸仁南瓜籽油的进一步开发利用提供科学依据。
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
1.1.1 材料与试剂
裸仁南瓜籽油：依据本课题组专利[15]方法通过超临界CO2萃取，在萃取压力25 MPa，萃取温度40 ℃，分离温度50 ℃，分离压力10 MPa条件下获得；
葡萄籽油、亚麻籽油：河南省鲲华生物技术有限公司；
角鲨烯标准品：纯度≥99.5%，中国药品生物制品检定所；
甲醇：色谱纯，德国Merch kGaA 公司；
DPPH(2，2-Diphenyl-1-picryhydrazyl)、ABTS[2,2-联氮双(3-乙基苯并噻唑啉-6磺酸)二铵盐]：分析纯，美国Sigma公司；
BSTFA+TMCS(99∶1)试剂： 梯希爱(上海)化成工业发展有限公司；
福林酚试剂：合肥博美生物技术有限公司；
Tris-HCl试剂：全式金生物技术有限公司；
没食子酸、氢氧化钾、正己烷、无水硫酸钠、石油醚、苯、二氯甲烷七水合硫酸亚铁邻苯三酚、过硫酸钾、铁氰化钾：分析纯，国药集团化学试剂有限公司；
三氯乙酸石油醚：沸程60～90 ℃，纯度≥98%，百灵威科技有限公司。
1.1.2 主要仪器设备
电子分析天平：AE240型，梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司；
pH计：S210 SevenCompact型，梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司；
气相色谱—质谱联用仪：GCMS-QP2020型，日本岛津公司；
紫外分光光度计：UV-1800型，日本岛津公司；
超声波清洗器：KQ5200DE型，昆山超声仪器有限公司；
电热恒温干燥箱：DHG9246型，上海精红实验设备有限公司；
离心机：2-16R型，湖南恒诺仪器设备有限公司。
1.2 方法
1.2.1 裸仁南瓜籽油质量检测
(1) 水分及挥发物的测定：直接干燥法，按GB 5009.236—2016进行，重复测定3次。
(2) 酸价的测定：冷溶剂指示剂滴定法，按GB 5009.229—2016进行，重复测定3次。
(3) 过氧化值的测定：滴定法，按GB 5009.227—2016进行，重复测定3次。
1.2.2 脂肪酸组成分析 准确称取裸仁南瓜籽油50.0 mg于试管中，加入体积比为1∶1的石油醚-苯混合溶剂2 mL溶解，加入0.4 mol/L的KOH-甲醇溶液2 mL，混匀后于室温放置30 min，加2 mL蒸馏水混匀，于5 000 r/min离心10 min，取上清液待测。采用峰面积归一法得出各脂肪酸的相对含量，各色谱峰相应的质谱图检索采用NIST标准普库。葡萄籽油和亚麻籽油作相同处理。
(1) GC条件：选用SH-RXi-5Sil MS (30 m×0.25 mm×0.25 μm) 毛细管色谱柱；升温程序为起始温度 70 ℃，保持3 min，以10 ℃/min 升温至 180 ℃，再以 2 ℃/min升温至200 ℃，保持1 min，最后以 3 ℃/min 升温至220 ℃，保持15 min；进样口温度250 ℃，载气为高纯氦气，分流比50∶1，柱流量1 mL/min，进样量1 μL，溶剂延迟3 min。
(2) MS条件：电离方式为EI，电子能量70 eV，离子源温度230 ℃，接口温度250 ℃，质量扫描范围是40～550 u，全扫描方式。
1.2.3 植物甾醇组成分析 取3.00 g裸仁南瓜籽油，加入1.5 mol/L 的KOH-乙醇溶液30 mL，于80 ℃水浴回流，进行皂化反应2 h。皂化完成，趁热加入5 mL的蒸馏水，以皂化液和正己烷体积比为1∶1萃取2次，皂化液和正己烷体积比为2∶1萃取1次，合并萃取液，经蒸馏水，20% KOH溶液，20%乙醇溶液，蒸馏水依次洗涤，至流出液为中性。合并上层正己烷层，加适量无水硫酸钠除水，旋转蒸发浓缩得干的不皂化物。取适量不皂化物，加200 μL BSTFA+TMCS(99∶1)试剂在80 ℃下衍生40 min，冷却，加入0.5 mL CH2Cl2溶液，得衍生化样品，待测。采用峰面积归一法得出各植物甾醇的相对含量，各色谱峰相应的质谱图检索采用NIST标准普库。葡萄籽油和亚麻籽油作相同处理。
(1) GC条件：选用SH-RXi-5Sil MS (30 m×0.25 mm×0.25 μm)毛细管色谱柱；升温程序为初始温度150 ℃，保持3 min，以15 ℃/min升至290 ℃，保留20 min；进样口温度280 ℃，载气为高纯氦气，分流比50∶1，柱流量1 mL/min，进样量1 μL，溶剂延迟3 min。
(2) MS条件：EI离子源，电子能量70 eV，离子源的温度为230 ℃，接口温度为280 ℃，质量扫描范围是40～550 u，全扫描方式。
1.2.4 角鲨烯含量测定
(1) 供试样品溶液制备：取1.2.3所得的不皂化物，加甲醇溶解，定容至10 mL。得供试样品。所制得的供试样品按照1.2.4(3)色谱检测条件进样，计算裸仁南瓜籽油角鲨烯含量，试验设置3组平行。葡萄籽油和亚麻籽油作相同处理。
(2) 角鲨烯的标准曲线：准确称取角鲨烯标准品20.0 mg，用甲醇溶解并定容至10 mL，获得浓度为2 mg/mL的母液。分别取0.15，0.30，0.45，0.60，0.75 mL于10 mL容量瓶，溶解定容，制成0.30，0.60，0.90，1.20，1.50 mg/mL的标准溶液，按照1.2.4(3)色谱检测条件进样5 μL，以角鲨烯浓度为横坐标，峰面积为纵坐标制作标准曲线。
(3) 高效液相色谱条件：Agilent-ZORBAX SB-C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相为甲醇，等度洗脱；柱温30 ℃，流速0.8 mL/min，进样10 μL，检测波长210 nm。
1.2.5 抗氧化活性研究
(1) 清除 DPPH自由基能力的测定：参考文献[16～17]的方法，研究裸仁南瓜籽油清除 DPPH自由基的能力。葡萄籽油和亚麻籽油作相同处理。
(2) 清除ABTS自由基能力的测定：参考文献[18]的方法，研究裸仁南瓜籽油清除ABTS自由基的能力。葡萄籽油和亚麻籽油作相同处理。
(3) 抗氧化能力评价指标的计算：以油样浓度为横坐标，抗氧化能力为纵坐标，研究其相关性及变化趋势，求得计算公式。50%清除率对应的浓度值为油样自由基清除能力的IC50值，R为相关系数，表示相关性(R值越接近1，相关性越好)。
1.2.6 数据处理 通过Excel 2013处理数据，利用OriginPro 8.6作图。
2 结果与分析
2.1 裸仁南瓜籽油质量
裸仁南瓜籽油的水分及挥发物为0.03%、酸价为1.32 mg/g、过氧化值为0.03 g/100 g，符合LS/T 3250—2017标准。
2.2 脂肪酸组成
裸仁南瓜籽油、葡萄籽油、亚麻籽油脂肪酸的GC-MS总离子流图见图1，脂肪酸组成及相对含量见表1。结果表明：裸仁南瓜籽油含有12种脂肪酸，以棕榈酸、硬脂酸、共轭亚油酸为主。其中饱和脂肪酸8种，不饱和脂肪酸4种。不饱和脂肪酸含量高达74.68%，其中顺式单不饱和脂肪酸、多不饱和脂肪酸相对含量分别为29.14%，45.54%。
2.3 植物甾醇组成
裸仁南瓜籽油、葡萄籽油、亚麻籽油植物甾醇的GC-MS总离子流图见图2，植物甾醇组成及相对含量见表2 。结果表明：3种油脂中植物甾醇含量最高的均为β-谷甾醇，在裸仁南瓜籽油中，β-谷甾醇含量达30.75%，△-7植物甾醇(麦角甾-7,22-二烯-3β-醇、胆甾-7-烯-3β，5α-二醇)含量相对较高，达10.76%，在葡萄籽油和亚麻籽油未检测出麦角甾-7,22-二烯-3β-醇。
2.4 角鲨烯含量
角鲨烯标准品、裸仁南瓜籽油、葡萄籽油、亚麻籽油的HPLC色谱图见图3。角鲨烯标准曲线方程为Y=11.048X-17.61，R2=0.997 2，角鲨烯含量在300～1 500 μg/mL时线性关系良好；供试样品连续进样6次，RSD为7.15%。根据标准曲线计算，裸仁南瓜籽油、葡萄籽油、亚麻籽油中角鲨烯含量依次为5 490.00，68.45，19.62 μg/g。裸仁南瓜籽油中的角鲨烯含量显著高于葡萄籽油和亚麻籽油。
图1 脂肪酸检测的总离子流图
表1 脂肪酸组成及相对含量†
† “*”表示不饱和脂肪酸；“—”表示未检测出。
表2 植物甾醇组成及相对含量†
† “—”表示未检测出。
2.5 抗氧化活性评价
2.5.1 DPPH自由基清除能力 图4和表3表明，3种油对DPPH自由基的清除能力与其浓度呈正相关，其中裸仁南瓜籽油对DPPH自由基具有良好的清除能力。裸仁南瓜籽油在浓度为20 mg/mL时， 清除率达52.20%，高于葡萄籽油(37.98%)和亚麻籽油(43.51%)的。从IC50值来看，3种油对DPPH自由基清除能力大小顺序为：裸仁南瓜籽油>亚麻籽油>葡萄籽油。
2.5.2 ABTS自由基清除能力 图5和表4表明，3种油对ABTS自由基的清除能力与其浓度呈直线正相关，其中裸仁南瓜籽油对ABTS自由基具有较优的清除能力。在低浓度时，裸仁南瓜籽油和亚麻籽油对ABTS自由基清除能力相当，均低于葡萄籽油；随着浓度的增加，裸仁南瓜籽油对ABTS自由基清除能力增长快于其他2种油，浓度为16 mg/mL 时，裸仁南瓜籽油对ABTS自由基的清除能力与葡萄籽油相当，优于亚麻籽油。从IC50值来看，3种油对ABTS自由基清除能力大小顺序为：葡萄籽油>裸仁南瓜籽油>亚麻籽油。
图2 植物甾醇检测的总离子流图
3 结论
通过对裸仁南瓜籽油的活性成分检测分析，裸仁南瓜籽油的不饱和脂肪酸、β-谷甾醇、△-7植物甾醇和角鲨烯含量分别为74.68%，30.75%，10.76%，5 490 μg/g，其β-谷甾醇、△-7植物甾醇和角鲨烯含量显著高于葡萄籽油和亚麻籽油，角鲨烯含量显著高于文献[19]报道的市售普通南瓜籽油的平均含量(1.14 μg/g)。天然植物甾醇具有良好的降胆固醇、抗炎、抗癌等功效[20-21]，△-7植物甾醇可抑制由二氢睾酮过多引起的前列腺增生[22]；角鲨烯为天然的抗癌、抗氧化剂，被广泛应用到食品、化妆品和医药行业[23]。因此可将裸仁南瓜籽油开发为具有降胆固醇、抗癌、抗氧化的保健油脂或进一步研究其功能成分，应用到化妆品、药品等行业。
图4 不同油脂对DPPH自由基的清除率
图5 不同油脂对ABTS自由基的清除率
油样线性回归方程IC50/(mg·mL-1)R裸仁南瓜籽油y=27.830ln(x)-27.40916.140.973 4葡萄籽油 y=39.911ln(x)-79.45025.620.989 3亚麻籽油 y=34.832ln(x)-56.74021.420.979 5
表4 不同油脂对ABTS自由基的清除效果
对裸仁南瓜籽油进行体外抗氧化活性评价发现，裸仁南瓜籽油对DPPH、ABTS自由基具有良好的清除能力，抗氧化活性较强，可能与其高含量的不饱和脂肪酸、植物甾醇，尤其是角鲨烯相关，但具体机制还需进一步研究。下一步将对裸仁南瓜籽油的活性部位进一步分离纯化，以明确其抗氧化作用的主要组分及裸仁南瓜籽油抗氧化机制。
