橙油和桉树油溶剂对人牙周膜成纤维细胞增殖抑制作用的实验研究

罗浩 徐佩琼 郑治国

根管再治疗术是常规根管治疗失败后保存患牙的首选治疗手段[1]，其目的为彻底清除填充物质及感染病灶，恢复根尖周及牙周组织的健康状态[2]。根管再治疗术成功的关键在于对根管系统的彻底清理及对原有根管形态的最大限度的保护[3]。其中，根管再治疗术的第一步为充分去除患牙根管的充填材料。因此如何选择恰当的方法，能够保护原有根管系统的同时去除根充材料，成为根管再治疗领域研究的重点课题。

目前根管在治疗术中去除根充材料应用的方法包括物理和化学方法。其中化学方法是指在去除根充材料时辅助使用氯仿、二甲苯、乙二胺四乙酸(EDTA)等有机溶剂溶解牙胶尖，使根充材料更容易取出。氯仿作为最常用的有机溶剂应用于根管再治疗中，由于其有一定的生物毒性，故临床应用受到争议[4]。近年来，橙油作为一种相对安全有效的有机溶剂逐步应用于根管再治疗的临床应用中[5]。然而，橙油等有机溶剂对牙周及根尖周组织是否存在一定的细胞毒性尚无实验证实。本实验通过体外细胞培养及噻唑蓝比色法(MTT)观察不同浓度的橙油对人牙周膜成纤维细胞(human periodontal ligament fibroblasts,hPDLFs)的细胞毒性，并与氯仿及桉树油进行对比，为橙油作为清除根充材料有机溶剂的临床应用提供安全性依据。

1 材料与方法

1.1 主要材料、试剂和仪器

橙油、氯仿、桉树油(Formula &Ação Farmácia, 巴西)；胎牛血清(fetal calf serum,FBS)(Gibco，美国)；酶标仪Model-680(Bio-Rad公司，美国)；I型胶原酶、DMEM培养基(Hyclone公司，美国)；溴化-3-(4,5-二甲基噻唑基-2)-2,5-二苯基四氮唑(MTT)、胰蛋白酶(Sigma,美国)；二氧化碳细胞培养箱(Heraeus公司，德国)；激光共聚焦显微镜(Leica公司，德国)；纯水系统Milli-Q(Millipore公司，美国)；电子天平BL-6(Sartorius公司，德国)；生物安全柜Hfsafe900(Heraeus公司，德国)；压力蒸汽灭菌器(Sanyo公司，日本)。

1.2 hPDLFs的采集及培养

hPDLFs收集自12～18 岁正畸患者因正畸需要而拔除的前磨牙。刮取牙根中1/3处的牙周膜，剪成0.5 mm2块，均匀置于培养瓶底，各组织间隔3 mm，置于37 ℃、5%CO2、100%湿度的恒温孵育箱培养，隔天换液。待细胞爬满瓶底75%～80%时传代：吸去培养液，PBS漂洗3 次以防止胎牛血清影响胰蛋白酶的消化作用。用 0.25%的胰蛋白酶消化1 min，倒置显微镜下观察发现细胞收缩变圆、胞体透亮、细胞之间间隙增大时，加入含血清的培养基终止消化。吹打细胞并将细胞悬液转移至无菌离心管，离心(1 000 r/min,5 min)后倒去上清液，加入适量的培养基重悬细胞，细胞计数后以1.0×105个/ml密度接种于培养皿中，完成第一次传代。取第4～6代细胞用于后续实验。

1.3 分组培养细胞

分别将橙油、桉树油及氯仿用含10%胎牛血清的DMEDM培养基配制成质量分数为0.1%和1%的稀释液备用。细胞消化后用含10%胎牛血清的DMEM培养液配成单个细胞悬液，以每孔2 000 个细胞接种到96 孔板，每孔体积200 μl；接种24 h观察细胞贴壁后更换为0.1%及1%有机溶剂培养液培养细胞，对照组换液为含10%胎牛血清的基础培养液；同一培养条件，培养1～12 h，于1、6及12 h检测细胞增殖活力。

1.4 MTT细胞增殖实验

培养1、6及12 h后，每孔加MTT溶液20 μl，继续孵育4 h，终止细胞生长。小心吸弃孔内培养上清液，对于悬浮细胞需要离心后再吸弃孔内培养上清液，每孔加150 μl DMSO，振荡10 min，使结晶物充分融解。选择490 nm波长，在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸收值，记录结果，以时间为横坐标，吸光值为纵坐标绘制细胞生长曲线。

1.5 统计学分析

2 结 果

2.1 hPDLFs形态特征

倒置显微镜下观察可见，细胞呈星形或长梭型，核圆形或椭圆形，有2～4 个胞质突，核仁清晰可见，呈现出典型的成纤维样细胞形态(图 1)。符合hPDLFs的形态学表现[6]。

图 1 hPDLFs形态特征 (×20)

2.2 细胞毒性试验结果

MTT细胞增殖实验结果示：①在培养1、6及12 h后，hPDLFs数量逐渐增多，获取的人牙周膜干细胞具有良好的增殖性能；②较低浓度(0.1%)的有机溶剂橙油、桉树油及氯仿对hPDLFs的增殖无显著影响，在低浓度下3 种有机溶剂均未表现出显著的细胞毒性；③1%浓度的有机溶剂橙油、桉树油及氯仿均表现出对hPDLFs增殖的抑制作用，具有统计学差异，且随接触时间延长该抑制作用呈现出增强的趋势；④在3 种有机溶剂中，橙油对hPDLFs的抑制性显著低于桉树油及氯仿，且在1、6及12 h时间节点均有统计学差异(图 2)。

图 2 应用不同浓度橙油、桉树油及氯仿培养第1、6和12 h时，hPDLFs的增殖活性检测(*:与对照组比较，P<0.05；#：与1%橙油组比较，P<0.05)

3 讨 论

选用恰当的方法去除根管内填充物是提高根管再治疗成功率的重要环节[7]，但根管系统的复杂结构使根管内充填物难以彻底去除[8]。化学有机溶剂的正确使用能够有效溶解根管内牙胶尖等充填物，提高医生的临床操作效率[9]。本研究针对橙油、桉树油及氯仿3 种临床常用有机溶剂对人牙周膜干细胞的毒性进行研究和探讨，初步明确了在所讨论的3 种有机溶剂中，橙油具有相对较低的细胞毒性，可作为根管再治疗的安全有机溶剂，本实验为橙油的临床应用提供参考。

现阶段根管再治疗临床工作中，氯仿以其高溶解性作为最有代表性的有机溶剂之一。自1976 年美国药品食物管理局(FDA)禁止在药品和化妆品配方中添加氯仿以来，氯仿在根管再治疗中的使用备受争议[10]。除诸多研究证实氯仿具有致癌作用外[11]，Lee等[12]研究证实氯仿可通过调节JNK和ERK信号通路诱导过敏反应性疾病。故而，氯仿作为有机溶剂具有一定的临床应用局限性，近年来随着材料工程技术的进步出现了一系列有机溶剂替代品。桉树油和橙油具备较为优良的临床可操作性能，具有相对较好的有机溶解性能。Julia等[13]以蒸馏水作为对照组，比较了桉树油、橙油及氯仿的溶解特性，结果证实，桉树油及橙油具有与氯仿相似的溶解性能。该研究结果提示，根管再治疗过程中使用桉树油和橙油亦有可能达到溶解根充材料的目的。然而，有关3 种有机溶剂对牙周及根尖周组织是否具有伤害性作用尚未见报道。

在根尖周牙周组织中，hPDLFs是最为主要的细胞成分之一，也是牙周膜的主要功能细胞[14]。hPDLFs参与牙周膜纤维的破坏与修复，是参与牙周组织改建与修复的重要成分之一[15]。在根管治疗与根管再治疗过程中，牙周膜细胞行使了重要的组织修复功能。本次试验通过噻唑蓝比色法检测了橙油、桉树油及氯仿对牙周膜成纤维细胞增殖的作用。MTT实验结果证实，3 种有机溶剂中，橙油对hPDLFs增殖性能影响最小，桉树油与氯仿影响较大且有统计学差异。该结果提示，与桉树油及氯仿相比，橙油具有相对安全的特性，对hPDLFs增殖情况影响较小，有可能作为氯仿的临床替代产品，从而减轻根管再治疗过程中由于化学有机溶剂的使用造成的二次创伤，有望减轻根管再治疗中的患者临床反应，并在一定程度上提高医生诊治效率。进一步可探讨橙油、桉树油对hPDLFs作用的分子机制及其生物安全性，为临床应用奠定理论基础。