多囊卵巢综合征患者卵母细胞超微结构观察

郭 楠 许 波

多囊卵巢综合征(polycystic ovary syndrome, PCOS)是一种复杂的生殖内分泌及代谢性疾病，育龄妇女的发病率约为10%，占无排卵性不育患者的30%～75%，以持续性月经异常、雄激素分泌过多以及卵巢多囊性改变为特征，主要临床表现为月经周期不规律、不孕、多毛和/或痤疮，主要助孕措施包括生活方式调整、药物干预、腔镜手术以及辅助生殖技术[1-2]。PCOS合并不孕症患者在行体外受精-胚胎移植周期时，其胚胎质量、临床妊娠率等多个指标均低于输卵管性因素(输卵管梗阻、粘连等)导致不孕的患者[3-5]。进一步研究[4-5]认为，PCOS患者卵母细胞质量下降是造成PCOS患者临床结局(包括优质胚胎率、种植率、临床妊娠率和活产率等)较差的主要原因之一。但目前尚缺乏关于卵母细胞质量下降原因的研究。因此，本研究对PCOS患者的卵母细胞超微结构进行分析以及检测线粒体DNA(mitochondria DNA, mtDNA)拷贝数，探讨PCOS患者卵母细胞质量下降的影响因素，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 研究对象 选取中国科学技术大学附属第一医院生殖医学中心2017年1～12月接受卵胞质内单精子注射技术(intracytoplasmic sperm injection，ICSI)治疗的115例不孕患者作为研究对象，年龄25～33岁，男方均为重度少弱精症或梗阻性无精症患者，男女双方染色体检查正常，均无糖尿病家族史。按女方是否伴PCOS分为试验组(PCOS组，n=57)和对照组(非PCOS组，n=58)。试验组均符合鹿特丹PCOS诊断标准[1-2]：①不排卵或偶发排卵；② 雄激素水平升高(>1.0 nmol/mL)，并排除其他因素(如先天性肾上腺皮质增生、分泌雄激素肿瘤等)；③超声显示卵巢增大，单侧直径2～9 mm的卵泡≥12枚，或单侧卵巢体积>10 mL。对照组:①平素月经规律；② 超声检查无多囊卵巢改变；③ 基础生殖内分泌无异常，且无全身及其他妇科、内分泌等疾病。

1.2 方法

1.2.1 卵母细胞获取 所有研究对象采用标准长方案[3]控制性促排卵，即从前一月经周期的黄体中期开始皮下注射促性腺激素释放激素激动剂进行垂体降调节，14天后行卵泡刺激素、促黄体生成素、雌激素水平检测和阴道超声检查，适时加用促性腺激素(国药准字H20052130，丽珠集团丽珠制药厂，药品规格：以尿促卵泡素效价计75 IU)150～300 IU，当至少有2枚卵泡直径≥18 mm或至少3枚卵泡直径≥17 mm时，注射重组人绒毛膜促性腺激素(注册证号：S20110045；生产单位：Merck Serono Europe Limited；药品规格：250 μg)250 μg，36～38 h行超声引导下经阴道穿刺取卵术。

收集废弃卵母细胞(常规ICSI 42～48 h后未分裂的成熟受精卵母细胞)共187 枚，其中试验组52枚用于超微结构观察，另38枚用于mtDNA拷贝数检测；对照组57枚和40枚分别用于超微结构观察和mtDNA拷贝数检测。

1.2.2 卵母细胞超微结构观察 将卵母细胞样本置戊二醛(25 g/L)4℃固定6 h，1×硝酸缓冲盐溶液洗涤；常温下1%锇酸固定1.5 h，之后乙醇梯度脱水。样本完成脱水后，环氧丙烷透明30 min，置环氧丙烷与环氧树脂(1∶1)混合液中浸透至少1.5 h，环氧树脂包埋，65℃烤箱中固化4 h。以60～80 nm厚度对包埋组织进行切片，后醋酸双氧铀及柠檬酸铅双重染色，制备好的电镜样品JEM- 1230 型透射电镜下观察。

1.2.3 卵母细胞线粒体数量统计与mtDNA拷贝数检测 卵母细胞电镜切片中，具有圆滑的椭圆形或者纺锤形，线粒体内的横嵴清晰，结构完整的线粒体标记为正常线粒体并计数；而整体轮廓不清晰，内含空泡，缺少明确的嵴结构标记为异常线粒体并计数。同时，对每张切片的卵母细胞面积进行计算。每个卵母细胞至少统计随机选取的3张电镜切片，之后统计每个卵母细胞单位面积内的线粒体数量，计算正常/异常线粒体比例。

卵母细胞经NaH2PO4(pH 2.0)去除透明带后入液氮保存。采用荧光实时定量PCR法检测卵母细胞mtDNA拷贝数，SYBR premix ExTaqTMII试剂盒购自日本TaKaRa公司。反应体系：5 μL SYBR+0.4 μL引物+3μL模板，补水至10 μL。聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)反应条件：95℃变性10 s，95℃变性5 s后61℃退火31 s，共40个循环。PCR操作在ABI 7500 实时荧光定量PCR扩增仪(Applied Biosysterms公司)完成，内标曲线由10倍稀释液生成，标准品为1 ng PCR产物中含有158 bp的5.8×109双链DNA分子，每次反应的标准曲线通过标准品确定，每个样品的起始 mtDNA 拷贝数通过此标准曲线来确定。卵母细胞mtDNA拷贝数分析的引物序列为,ND1-F :5’-GGCTACATACAATTACGCAAAG-3’,R :5’-TAGAATGGAGTAGACCGAAAGG -3’。

1.3 观察指标 入院后收集患者的一般资料，包括年龄、体质指数(body mass index，BMI)。并于月经第2～3天清晨空腹采血检测生化指标。卵母细胞电镜下超微结构观察细胞结构和数量及mtDNA拷贝数的荧光实时定量PCR检测结果。

2 结果

2.1 两组患者临床资料比较 两组患者年龄、基础雌激素、基础卵泡刺激素、基础催乳素水平差异均无统计学意义(P>0.05)，试验组体质指数、基础雄激素、基础促黄体生成素、血糖及胰岛素水平均高于对照组(P<0.05)。详见表1。

2.2 两组卵母细胞的超微结构比较 两组卵母细胞的透明带结构基本一致，均为网状的疏松结构，含有颗粒细胞碎片残留和少量纤维物。透明带与卵母细胞膜间存在卵周隙，卵周隙均可见树突状的微绒毛，胞膜近卵周隙的位置可见大量皮质颗粒，详见图1。两组高尔基体和内质网细胞的形态和分布均未见异常。

表1 两组患者一般临床资料比较

对照组卵母细胞线粒体分布均匀，功能和形态正常的线粒体呈现较为圆滑的椭圆形或纺锤形，线粒体内的弧形或横嵴较为清晰，结构完整。试验组大量的线粒体结构不清晰，缺少明确的嵴结构，且整体轮廓不清楚，内含空泡。试验组中异常线粒体比例58.7%高于对照组17.7%，差异有统计学意义(χ2=10.260,P=0.037)，详见图2。同时，试验组卵母细胞内线粒体数量(44.3±9.6)个/切片低于对照组(65.4±12.7)个/切片，差异有统计学意义(t=3.670，P=0.042)，详见图3。

图1 卵母细胞透明带和细胞膜周边超微结构

注：ZP为透明带，PVS为卵周隙；黑色箭头为皮质颗粒，白色箭头为微绒毛；标尺为500 nm

图2 卵母细胞内线粒体结构比较

注：黑色箭头为正常线粒体；白色箭头为异常线粒体

图3 卵母细胞内线粒体数量比较

注：圆圈内表示单位面积内线粒体数量

2.3 卵母细胞内mtDNA拷贝数检测 利用荧光实时定量PCR检测两组卵母细胞内mtDNA拷贝数。结果，试验组卵母细胞内mtDNA拷贝数(54 390±19 139)个低于对照组(88 135±44 235)个，差异有统计学意义(t=6.321，P=0.027)。

3 讨论

PCOS是育龄妇女最常见的生殖内分泌疾病。PCOS患者的内分泌环境复杂，特征表现为卵泡期基础黄体生成素水平升高，并常伴有高雄激素血症、高胰岛素血症以及肥胖等多种内分泌及代谢异常[2]。本次研究提示,PCOS组患者体质指数、基础雄激素、黄体生成素、血糖、胰岛素水平较正常对照组均有显著升高，与上述研究结果一致。同时有研究[3-5]证实，PCOS患者的ART临床结局较差，表现为受精率和种植率下降，其主要原因与卵母细胞质量下降和胚胎发育潜能降低有关[5,7]，并发现PCOS患者卵泡液内的一些对卵母细胞质量及发育潜能起负面影响的细胞因子如肿瘤坏死因子-α、粒细胞集落刺激因子等出现异常表达[8-9]。尽管这些研究都认为PCOS患者卵母细胞质量会下调，但是其结论主要来源于临床结局的推论或生化指标变化的推测，而病理机制尚不完全清楚。

线粒体是卵母细胞中数量最多，也是最重要的细胞器，参与卵母细胞的基本生理活动如生发泡破裂、纺锤体形成、染色体分离等[6,11]。线粒体结构和功能的改变将直接影响卵母细胞的代谢、增殖和分化[11-12]。有研究[13-14]发现，成熟卵母细胞内的线粒体明显多于未成熟卵母细胞，且卵母细胞发育能力与线粒体数量呈正相关；高龄女性的卵母细胞中mtDNA拷贝数明显低于年轻女性，且随年龄增长，线粒体内mtDNA的突变率明显增高，线粒体膜电位与ATP水平逐渐降低。直接观察卵母细胞内部的超微结构是评估卵母细胞质量最直接和客观的方法[10]。本研究联合透射电镜和荧光实时定量PCR技术对PCOS患者卵母细胞内关键细胞器线粒体的结构和数量进行分析，结果显示PCOS患者卵母细胞内线粒体数量明显下降，且出现明显的形态学异常如缺少嵴结构，内含空泡，轮廓不清等，上述改变可能会导致卵母细胞能量代谢和氧化应激异常，最终影响卵母细胞和胚胎的质量。

综上所述，PCOS患者卵母细胞内异常线粒体比例升高和mtDNA拷贝数下降，可能会导致PCOS患者的卵母细胞中线粒体参与的能量代谢、氧化应激等关键过程受损，并最终反映为卵母细胞和胚胎质量的降低。