凋亡相关因子CCAR1、Par-4在胃腺癌中的表达及临床意义

吕蓉蓉，齐洁敏，陈 龙

（承德医学院，河北承德 067000）

胃癌是我国常见的消化道恶性肿瘤，病人的死亡率较高，预后也比较差，其发生、发展涉及到多种机制，不但与细胞的异常增殖有关，亦与细胞凋亡异常密切相关[1]。细胞周期与细胞凋亡调控蛋白1（cell division cycle and apoptosis regulator protein1，CCAR1）作为新近发现的一个重要的细胞凋亡相关基因，能促进细胞凋亡或抑制细胞生长，在调节细胞增殖和凋亡中发挥重要作用[2]。前列腺凋亡反应基因-4(prostate apoptosis response-4 gene，Par-4)是促凋亡基因，在正常细胞中不引起细胞凋亡，但在大多数恶性肿瘤细胞中Par-4蛋白由细胞质转移至细胞核引起细胞凋亡[3]。本研究采用免疫组化SP法检测了胃腺癌组织CCAR1蛋白、Par-4蛋白的表达情况，并分析了二者的表达与胃腺癌临床病理参数的关系，以及在胃腺癌中二者表达的相关性，以期为进一步明确胃腺癌的发生发展机制及为临床靶向治疗提供新的理论依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料 60例手术切除后经病理检查确诊的胃腺癌组织标本，所有患者术前均未进行放疗或化疗，其中男37例、女23例；年龄＞60岁41例、≤60岁19例；分化程度：19例高分化，14例中分化，27例低分化；浸润深度：40例未穿透肌层，20例穿透肌层；淋巴结转移：38例有淋巴结转移，22例无淋巴结转移；TNM分期：Ⅰ+Ⅱ期34例，Ⅲ+Ⅳ期26例。选取同期40例癌旁组织（距离胃癌组织边缘＞5cm），病理检查证实为正常胃黏膜的组织标本为对照组，其中男25例、女15例，年龄35～78岁。

1.2 染色方法 所收集标本经10%福尔马林液固定，石蜡包埋制成蜡块，5 μm厚连续切片。采用免疫组化SP法、DAB显色法检测CCAR1蛋白和Par-4蛋白的表达情况，按照试剂盒说明书进行操作。其中兔抗Par-4试剂来自北京博奥森生物技术有限公司，抗体使用浓度为1：400；兔抗C C A R 1试剂来自杭州联科生物技术有限公司，抗体使用浓度为1：200。用已知阳性切片作为阳性对照，用PBS代替一抗作为空白对照。

1.3 结果判定标准[4]CCAR1阳性染色为细胞质或细胞核出现棕黄色颗粒，Par-4阳性染色为细胞质出现棕黄色颗粒。由两位高年资的病理医师通过双盲法对切片进行诊断，依次在低倍显微镜、高倍显微镜下观察切片，每张切片随机选取4个高倍视野（×400），依据染色强度及阳性细胞所占比例综合判定结果。根据染色程度：未着色为0分、淡黄色为1分、棕黄色为2分、棕褐色为3分；根据染色细胞所占比例：阳性细胞数＜5%为0分，＜25%为1分，＜50%为2分，≥50%为3分。将上述两项得分相乘得到最终结果：0～1分为阴性(-)，＞1分记为阳性(+)。

1.4 统计分析 应用SPSS 19.0软件进行统计学分析，计数资料的组间比较采用卡方检验，相关性分析应用Spearman相关分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CCAR1蛋白与Par-4蛋白的表达（图1-2） 60例胃腺癌组织中，CCAR1蛋白、Par-4蛋白表达的阳性率为分别为81.6%（49/60）、28.3%（17/60）；40例正常胃黏膜组织中，CCAR1蛋白、Par-4蛋白表达的阳性率分别为32.5%（13/40）、82.5%（33/40）。胃腺癌组织中CCAR1蛋白的阳性表达率明显高于正常胃黏膜，Par-4蛋白的阳性表达率明显低于正常胃黏膜，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1：

表1 CCAR1、Par-4蛋白在胃腺癌和正常胃黏膜中的表达

图1 CCAR1蛋白的表达情况(免疫组化SP法，×200)

图2 Par-4蛋白的表达情况(免疫组化SP法，×200）

2.2 CCAR1蛋白、Par-4蛋白表达与胃腺癌临床病理参数的关系 胃腺癌组织中，CCAR1蛋白表达与性别、年龄、TNM分期、淋巴结转移、浸润深度无关(P＞0.05)；与分化程度有关，高/中分化明显高于低/未分化(P＜0.05)。胃腺癌组织中，Par-4蛋白表达与性别、年龄、浸润深度无关(P＞0.05)；与分化程度、TNM分期、淋巴结转移有关(P＜0.05)：低/未分化明显低于高/中分化，TNM分期Ⅲ+Ⅳ期明显低于Ⅰ+Ⅱ期，有淋巴结转移明显低于无淋巴结转移。见表2：

表2 CCAR1蛋白、Par-4蛋白表达与胃腺癌临床病理参数的关系

2.3 胃腺癌组织中CCAR1、Par-4蛋白表达的相关性Spearman相关分析显示，胃腺癌组织中CCAR1蛋白表达与Par-4蛋白表达无相关性(r=-0.08，P＞0.05）。见表3：

表3 胃腺癌组织CCAR1、Par-4蛋白表达的相关性

3 讨论

中国最新癌症统计资料显示，在我国每年新发癌症病例达429万例，占全球新发癌症病人数的20%，癌症的防治已成为我国重要的公共卫生问题[5]。大量研究显示，恶性肿瘤的发生与细胞凋亡之间存在着密切联系，近来的研究更注重细胞凋亡抑制在肿瘤发生中的作用。

CCAR1蛋白是一种核内磷酸化蛋白，在调节细胞增殖和凋亡中发挥重要作用[6]。Seo等的研究显示，CCAR1蛋白及mRNA在前列腺癌组织中的表达高于正常前列腺组织，CCAR1高表达可促进前列腺癌细胞的生长[7]；在肝细胞癌的相关研究中发现，CCAR1蛋白在肝细胞癌中过表达，并与微血管浸润、肝内转移密切相关[8]。本研究采用免疫组化SP法检测了胃腺癌组织与癌旁正常胃黏膜组织CCAR1蛋白的表达情况，发现胃腺癌CCAR1蛋白的阳性表达率明显高于正常胃黏膜，并且胃腺癌CCAR 1蛋白的表达与胃腺癌的分化程度有关，提示CCAR1蛋白的过表达与胃腺癌的发生、发展有密切关系。

Par-4是一种促凋亡因子，可通过内源性和外源性两种途径选择性的诱导肿瘤细胞凋亡，而对正常细胞没有影响[9]。研究显示，Par-4蛋白在胰腺癌[10]、前列腺癌[11]、子宫内膜癌[12]、急慢性淋巴细胞白血病[13]、肾母细胞瘤[14]及喉癌[15]等多种恶性肿瘤中表达降低。本研究采用免疫组化SP法检测Par-4蛋白的表达情况时发现，胃腺癌Par-4蛋白的阳性表达率明显低于正常胃黏膜，并且胃腺癌Par-4蛋白的表达与分化程度、TNM分期和淋巴结转移有关，提示Par-4可作为判断胃腺癌发生发展的分子生物学指标。

在急性淋巴细胞白血病的研究中显示，Par-4蛋白可与转录因子THAP1形成复合物，并与Notch 3竞争性调节CCAR1前体mRNA的剪接，影响CCAR1蛋白的表达[16]。在胃腺癌中，Par-4与CCAR1蛋白的相互作用尚不明确。本研究发现，胃腺癌组织Par-4蛋白表达与CCAR1蛋白表达无明显相关性。

综上所述，Par-4蛋白与CCAR1蛋白均参与了胃腺癌的发生和进展过程，但二者在胃腺癌的发生过程中可能受不同机制的调控，可通过进一步探究，明确二者在胃腺癌发生发展过程中的相互作用，为胃癌的靶向治疗提供新的理论依据。