冷却速率对洋葱内表皮细胞结构的影响

2018-12-11

制冷学报 2018年6期

(天津商业大学天津市制冷技术重点实验室天津 300134)

现代社会飞速发展，生活水平不断提高，人们对食品营养品质的关注度逐步提升[1]。我国初级果蔬产品占比达90%，而采摘后损失率达25%～30%[2-3]。冷冻冷藏可以更好的保存食品品质。M. Fuchigami等[4-5]通过对胡萝卜进行冷却-复温，发现冷冻会影响细胞的结构和质地。T. Acharya等[6]利用低温显微镜研究了细胞渗透特性在冷却过程中的变化规律。但并不知晓冷却过程中，细胞内冰晶的生长过程。

Li Wei等[7]对细胞的冻存进行了研究，并模拟了胞内冰的生长过程。为了更真实的观察细胞内冰晶的生长情况，T. Ninagawa等[8]利用高速摄像机，观测了不同冷却速率下草莓天竺葵的叶子细胞内冰晶生长过程，发现不同冷却速率会影响冰晶生长方式及冰晶的大小。细胞组织的力学性能和形态参数对研究细胞结构和质地的变化至关重要。J. J. Ordaz-Ortiz等[9]使用拉伸方法测试了番茄组织强度，通过低温扫描电镜判定组织破坏机制。M. C. Alamar等[10]测定了不同品种和不同贮存条件下的苹果组织的力学性能和形态参数。娄耀郏[11]研究了弱强度的静磁场对食品冷冻的影响及其影响机理。宋健飞等[12]研究了直流磁场对洋葱细胞冻结过程的影响。

以上学者对植物细胞的冷冻过程、冰晶生长及生物组织的破坏机制进行了大量研究，然而，关于植物细胞在冷驱动下的力学特性研究较少。由于洋葱的内表皮细胞较大且规则，易于观察，因此，本文选取洋葱内表皮细胞为研究对象，利用低温显微镜，对细胞的冷却-复温过程进行观察，分析细胞在不同冷却速率下冰晶的大小及复温后细胞的形变，研究冷却速率的影响特性及细胞冷却过程中的结构变化。

1 实验装置及方法

1.1 实验台

实验采用低温显微镜系统，其温度控制范围为-196～125 ℃，热电偶为A级Pt100铂电阻，精度为±0.01 ℃，温度响应时间小于0.01 s，可实现迅速降温和精确控制。采用循环氮气吹扫冷台镜，防止镜口处形成湿气凝结，影响显微镜观测。

1.2 实验材料及方法

实验选用市场销售的洋葱作为取样对象，其大小均匀、成熟度一致、无病虫及损伤。实验步骤：1)取洋葱内表皮长宽为10 mm×10 mm，其厚度多次测量取均值为0.115 6 mm；2)将洋葱内表皮细胞置于载玻片，保证平整无气泡；3)将玻片置于低温显微镜中的样品池中，调至清晰；4)设置冷却速率为2、6、8、12、15、20、50、90 ℃/min，由常温降至结晶点并维持5 min，再以速率10 ℃/min复温至常温，拍照时间为1 张/s；5)利用Image-Pro Plus软件，对洋葱内表皮细胞的显微照片(放大至200倍)进行定量分析，记录细胞结晶温度和结晶所需要的时间。

2 实验结果

对不同冷却速率下洋葱内表皮细胞进行动态观察，得到细胞结晶温度、结晶时间及细胞外观形态的变化。结果表明，不同冷却速率下，细胞结构的变化趋势相同。以冷却速率为12 ℃/min的冷却过程为例，图1所示为洋葱内表皮细胞显微图片，随着温度的降低，细胞明显变得褶皱，细胞间隙逐渐形成冰晶，温度继续下降，直至细胞完全结晶。

图2 洋葱内表皮细胞时结晶照片与3D光强度图Fig.2 Onion epidermal cell images at the moment of crystallization and 3D light intensity with different cooling rates

2.1 胞内冰晶对细胞损伤的分析

透光强度可反映胞内冰晶的形成情况。图2所示为选取不同冷却速率下细胞结晶时的照片和通过Image-Pro Plus软件进行处理得到的细胞结晶时的3D光强度图。浅色部分代表透过细胞的光，可以看到冷却速率从2 ℃/min升至90 ℃/min的过程中，浅色对应的分布区域越来越稀少，与之对应的结晶时的照片显示越来越暗。图3所示为洋葱内表皮细胞结晶时的平均灰度值。由图3可知，冷却速率为2 ℃/min 时照片的平均灰度值为44.11%；2～15 ℃/min时平均灰度值下降了27.5%；2～90 ℃/min时平均灰度值下降了37.2%。

图3 洋葱内表皮细胞结晶时的平均灰度值Fig.3 Relationship between the cooling rate and the average gravy value

这说明冷却速率的快慢，对冰晶的生长产生了影响。当冷却速率较慢时，冰晶生长过程较为稳定，细胞内不易形成晶核，因此晶核的数量较少。冰晶在生长过程中受到其它冰晶的干扰较弱，形成的枝晶粗大且数量少，散射能力弱，透光能力强。当冷却速率升高时，冰晶形成过程的稳定程度下降，不仅细胞内形成的晶核变多，而且各个晶核在冰晶在生长过程中还会相互干扰，导致生长出的冰晶较为混乱，形成的枝晶小且数量多，散射能力强，因此细胞的透光能力下降。显然，当细胞内形成的冰晶较大时，会对细胞造成更大的机械损伤。

2.2 细胞形变的分析

有些文献中采用长短轴之比研究细胞的形变，其值虽然可以反映细胞的形变，但内因无从得知。假设细胞所受载荷是均匀的，细胞形变与细胞内压的变化相关联，因此本文在分析细胞形变时采用如下计算式[13]：

(1)

但此公式适用于圆形细胞，本实验选取的洋葱内表皮细胞为较为规则的矩形细胞。故用当量直径代替式(1)中的半径，可得式(2)：

(2)

细胞的面积及周长可通过Image-Pro Plus软件测量，洋葱表皮细胞的当量直径可由式(3)计算：

(3)

细胞的体积变化可由式(4)计算：

ΔV=V-V0

(4)

式中：γ为细胞壁的泊松比[14]，γ=0.33[14]；E为细胞壁的弹性模量，E=2.67×107N/m2；h为细胞壁的厚度，h=0.125×10-5m；L为细胞的周长，m；S为细胞的面积，m2；D0为细胞初始的当量直径，m；Di为细胞变形后的当量直径，m；R、r分别为细胞的直径和半径，m；V0、V分别为细胞初始和变化后体积，ΔV为细胞体积的变化，m3。

图4所示为不同冷却速率下体积与内压的变化。由图4可知，冷却过程中，从20 ℃降至4 ℃左右时，细胞内压增大；从4 ℃降至0 ℃时，内压略有减小；0 ℃之后，内压继续增大，直至细胞完全结晶。而体积的变化与内压变化趋势相反。当温度高于0 ℃时，细胞的体积在4 ℃附近出现最小值，这是因为水的密度在4 ℃时最小，随着温度继续降低，水的体积逐渐增大。当温度低于0 ℃时，细胞间隙逐渐形成冰晶，挤压细胞，并伴随着细胞水分外流，导致细胞体积减小，直到细胞完全冻结。

由图4还可以发现，复温过程与冷却过程类似，但当温度恢复至室温后，细胞的体积不会完全恢复。因此，无论冷却速率多大，均会对细胞产生影响，并且这种影响只能降低，不可避免。该影响与细胞内压的变化有紧密的联系。细胞内压的变化会对细胞形状产生直接影响。内压增大，体积减小，使其形状发生改变，当达到细胞的屈服极限时，细胞结构便会发生变化，致使细胞死亡。而且冷却速率越慢，这种影响越明显，与2.1节的结论一致。当冷却速率为2 ℃/min时，冷却-复温过程结束后，细胞内压增大了0.388×10-2Pa，体积减小了2.264×10-13m3。

图4 不同冷却速率下体积与内压的变化Fig.4 The volume and internal pressure vary with the temperature at different cooling rates

图5所示为冷却速率为2 ℃/min时洋葱内表皮细胞图像。对比图5(a)与(b)可知，复温后细胞结构发生了明显变化。

图5 冷却速率为2 ℃/min时洋葱内表皮细胞图像Fig.5 Pictures of cells in original state and after rewarming at cooling rate of 2 ℃/min

2.3 过冷度与结晶时间、细胞体积变化的关系

利用低温显微镜对不同冷却速率下的洋葱内表皮细胞进行观察，得到细胞结晶所需时间与结晶温度。结晶时间是指从初始状态至细胞完全结晶的时间。结晶温度为细胞完全结晶时的温度，将结晶温度转换为过冷度[14]，即：

ΔT=Tz-Ti

(5)

为了对比不同冷却速率对细胞形变的影响，利用式(6)计算细胞的相对体积变化[15-16]：

(6)

式中：ΔT为过冷度，℃；Tz为液体的凝固点，取0 ℃；Ti为细胞结晶时的温度，℃；VR为细胞冷却-复温前后的相对体积变化，%。

图6所示为冷却速率对过冷度、结晶时间、VR的影响。由图6可知，相对体积变化、结晶时间及过冷度在冷却速率为2～20 ℃/min时，变化较为剧烈，其中结晶时间缩短了86.45%，过冷度增加了7.5 ℃，VR由9.7%减小为3.05%。当冷却速率大于20 ℃/min后，三者的变化趋势变缓，直至90 ℃/min时，结晶时间缩短了32.89%，过冷度增大了7 ℃，结晶时VR由3.05%减小为2.45%。

图6 冷却速率对过冷度、结晶时间、相对体积变化的影响Fig.6 Effect of cooling rate on supercooling degree, crystallization time, and relative volume change

这是由于细胞间隙溶液浓度相对较小，当冷却速率较小时，细胞间隙处首先发生结晶现象，细胞外溶液浓度增高，细胞内水分发生迁移至细胞间隙。细胞间隙吸收水分的同时也在进行结晶，并释放潜热。而且冷却速率越慢，流向细胞间隙的水分越多，细胞间隙形成的冰晶越大，细胞结晶时的变形量越大，复温后细胞的变形量也越明显。当冷却至一定温度时，细胞内水分的化学键不再稳定，瞬间结晶，释放潜热。

当冷却速率较大时，短时间提供给细胞的冷量较多，温度下降较快，细胞间隙溶液迅速冻结，细胞内的水分来不及外流。因此结晶所需的过冷度较大，在结晶瞬间释放大量潜热。并且细胞间隙形成的冰晶较小，导致结晶后细胞变形量较小。当冷却过程中细胞的变形量较小时，恢复至室温后，细胞的变形量也随之减小。90 ℃/min时，冷却-复温结束后，VR仅为1.24%。因此冷却速率越大，过冷度越大，结晶时间越短，对细胞体积的影响也越小。而此时细胞能够恢复至初始状态的能力较强，最终对细胞造成的损伤较小。