人参中人参总皂苷测定方法研究

逄世峰，王佳，郑培和，许世泉，张浩，崔丽丽，马莹，王英平※，梁毅，单巍

（1.中国农业科学院特产研究所，长春 130112；2.吉林医药学院附属医院，吉林 吉林 132013；3.康美新开河吉林药业有限公司，吉林 集安 134299

人参（Panax ginseng C.A.Mey.）系五加科人参属多年生草本植物，在中国已有数千年的药用历史，《神农本草经》中记载：“人参，味甘、微苦，微温。主补五脏、安精神、定魂魄、止惊悸、除邪气、明目、开心、益智、久服轻身延年”[1]。人参皂苷是人参中的主要活性成分[2，3]，各国药典均以人参皂苷做为药材质量评价指标[4]。目前，人参的质量评价大多采用液相色谱法测定人参皂苷的含量，但往往忽略了齐墩果烷型人参皂苷和丙二酰基人参皂苷[5～7]，这2种类型人参皂苷具有独特的药理活性[8～10]。

本研究通过氨水将丙二酰基人参皂苷转化为相应的中性皂苷，采用超高效液相色谱测定人参中人参皂苷 Rg1、Re、Rf、Ro、Rb1、Rc、Rb2、Rb3、Rd 含量，为人参产品质量评价及标准制定提供理论参考。

1 试验仪器、试剂与材料

1.1 仪器与试剂

超高效液相色谱仪Acquity（Waters公司）；乙腈为色谱纯（Fisher），水为超纯水（Millipore），磷酸为优级纯，其他试剂均为分析纯；人参皂苷Rg1、Re、Rf、Ro、Rb1、Rc、Rb2、Rb3、Rd（中国药品生物制品检定所）。

1.2 材料

人参样品分为自制样品和成品，自制样品为采自黑龙江省和吉林省的不同产地鲜人参自制加工的生晒参，采样时间为2016年9月20日～2016年10月30日，共收集样品30份。经中国农业科学院特产研究所许世泉副研究员鉴定，全部样品均为五加科植物人参。成品购自吉林省、上海市、杭州市，参根于50°C烘干至恒重，粉碎，过60目筛，待测。样品采集信息见表1。

表1 样品信息表Table 1 Sample information form

续表1

续表1

2 方法与结果

2.1 对照品溶液制备

精密称取人参皂苷 Rg1、Re、Rf、Ro、Rb1、Rc、Rb2、Rb3、Rd 标准品 2.96mg、3.54mg、2.18mg、2.34mg、4.34mg、4.46mg、3.49mg、1.66mg、3.86mg，置于 10mL容量瓶中，加甲醇配置成不同浓度的混合对照品溶液。

2.2 供试品溶液制备

取1.0g的样品粉末，精密称定，置于50mL具塞磨口三角瓶中，加入25mL氨-水-甲醇溶液（NH3+H2O+CH3OH=4+21+75），密塞，超声提取 30min（功率500W，频率40kHz），静置48h，取上清液，过微孔滤膜，待测。

2.3 色谱条件

ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱（2.1 50mm，流动相：乙腈-0.0005%磷酸水溶液（梯度洗脱：0min～3min，17%～19%乙腈；3min～4min，19%～21%乙腈；4min～4.5min，21%～24% 乙 腈；4.5min～5min，24%～28%乙腈；5min～6.5min，28%乙腈；6.5min～7.5min，28%～30%乙腈；7.5min～9.5min，30%～36%乙腈；9.5min～11min，36%～40%乙腈），流速 0.5mL/min，柱温35℃，进样量

2.4 线性关系考察与定量限（LOQ）、检测限（LOD）

将混合对照品溶液分别用甲醇稀释100倍、5倍、2.5倍、1.25倍、1倍，制成一系列浓度的混合标准品溶液，依次注入高效液相色谱仪，按上述色谱条件测定峰面积，以峰面积为纵坐标、浓度为横坐标绘制标准曲线，计算回归方程。各种人参皂苷检出限（LOD）和定量限（LOQ）由3倍和10倍信噪比计算而来。结果见表2。

表2 线性方程、相关系数及检出限Table 2 Linear equation，correlation coefficient and detection limit

2.5 重复性试验

取供试人参样品，精密称取6份，按供试品溶液的制备方法处理，进样分析，测得人参皂苷Rg1平均含量为0.45%、RSD 0.78%，Re平均含量为0.39%、RSD0.71%，Rf平均含量为 0.11%、RSD1.62%，Ro平均含量为0.41%、RSD 0.4%，Rb1平均含量为1.23%、RSD0.54%，Rc平均含量为 0.56%、RSD0.4%，Rb2平均含量为0.57%、RSD0.48%，Rb3平均含量为0.1%、RSD1.94%，Rd平均含量为0.34%、RSD0.74%，表明重复性良好。

2.6 稳定性试验

取同一供试品溶液，室温下放置，分别于1d、2d、3d、4d、5d、6d、7d 按上述色谱条件进样分析，结果人参皂苷 Rg1、Re、Rf、Ro、Rb1、Rc、Rb2、Rb3、Rd 峰面积的RSD分别为1.01%、1.02%、0.71%、1.14%、0.96%、0.48%、1.04%、1.47%、1.11%，表明供试品溶液在7d内稳定。

2.7 回收率试验

精密称取已知含量的样品粉末6份，添加一定量的人参皂苷对照品，按“2.2”项下制备供试品溶液，在上述色谱条件下测定，结果见表3。

表3 加样回收率Tab.3 Recovery of sample (n=6)

2.8 样品测定

按照“2.2”项下供试品溶液的制备方法操作，按照“2.3”项下色谱条件测定样品。人参中主要含有Rg1、Re、Rf、Ro、Rb1、Rc、Rb2、Rb3、Rd 9 种人参皂苷，生晒参片中人参皂苷含量较低（样品32、43、44），生晒参须中人参皂苷含量较高（样品49、50、51），光支生晒参和全须生晒参主要人参皂苷含量之和在2.11%～6.01%之间。结果见表4，色谱图见图1。

图1 标准品（A）和样品（B）超高效液相色谱图Fig.1 UPLC chromatograms of reference substances（A）and sample（B）

表4 人参中9种人参皂苷含量Tab.4 Content of nine ginsenosides in the roots of ginseng

续表4

3 讨论

丙二酰基人参皂苷是生晒参中人参皂苷的主要组成成分，丙二酰基人参皂苷Rb1、Rb2、Rc、Rd的含量约占人参总皂苷的1/3[11]。韩国药典中采用氢氧化钠将丙二酰基人参皂苷转化为相应的中性皂苷，后用盐酸中和样品溶液[12]。该方法溶液稳定性较差，转化后的中性皂苷不稳定。本方法采用氨水转化丙二酰基人参皂苷，溶液稳定性良好。

为了明确丙二酰基人参皂苷转化情况，本研究考察了 12h、24h、36h、48h、60h共 5个时间点，结果表明，48h后相应中性人参皂苷含量不再增加，丙二酰基人参皂苷已转化完全。因此，提取时间应控制在48h以上。

流动相中磷酸的浓度直接影响齐墩果酸型人参皂苷Ro的峰型和分离度，本研究分别将25%磷酸加入500mL水中，考察不同浓度磷酸溶液流动相对色谱分离的影响，结果表明，乙腈 0.000 5%磷酸水溶液作为流动相时，Ro峰型和色谱分离良好，见图2。

图2 不同浓度磷酸UPLC色谱图Fig.2 UPLC chromatograms of different concentration of phosphoric acid

综上，人参中主要含有 Rg1、Re、Rf、Ro、Rb1、Rc、Rb2、Rb3、Rd 9 种人参皂苷，且含有大量 M-Rb1、MRb2、M-Rc、M-Rd丙二酰基人参皂苷，仅以某种或几种人参皂苷作为评价指标会低估人参总皂苷的含量。相比而言，先将丙二酰基人参皂苷转化为相应的中性皂苷，再将各单体皂苷进行加和作为人参质量评价指标更为合理。