微生物来源CpG免疫增强剂筛选与动物安全试验

刘艳环，李海涛，朱言柱，常彤，肖家美，苗利光

（中国农业科学院特产研究所，长春 130112）

特异性免疫是含有病原相关分子模式（PAMP）的反应物与天然免疫细胞上的模式识别受体（PRR）相结合，激活天然免疫应答，从而活化抗感染途径的过程[1]。高度纯化的新型疫苗因缺少PAMP成分，不能被天然免疫细胞的PRR很好地识别，不足以产生引起免疫应答的有效信号。CPG-DNA作为佐剂可以克服新型疫苗PAMP不足的缺陷，通过模拟感染过程诱导强烈的免疫应答[2]。本项研究为筛选适合亚单位疫苗免疫的CpG佐剂，通过淋巴细胞增殖试验筛选出对羊、小鼠淋巴细胞都有较强细胞增殖作用的序列，为CpG佐剂的研制与应用提供理论依据.

CpG-DNA是一些具有免疫激活功能的以未甲基化的CpG基序为核心的DNA序列，它包括含CpG基序的人工合成的寡聚脱氧核苷酸（Oligodeoxynucleotides，ODN）和自然界中细菌、病毒、无脊椎动物等低等生物的基因组DNA。长期以来，DNA被认为只具有较弱的免疫原性，难以引起机体强烈的免疫反应。虽然早在1965年Braw等发现，用寡聚脱氧核苷酸与绵羊红细胞一起注射小鼠，可明显提高小鼠对绵羊红细胞的免疫应答水平，并首先提出寡聚脱氧核苷酸具有免疫佐剂的观点。但是，DNA的免疫调节作用被广泛认识和重视是在20年后，人们研究结果表明，DNA是刺激免疫反应的重要成分之一，特别是具有特定序列的细菌 DNA或经化学修饰的DNA能刺激机体产生极为强烈的免疫应答。这类DNA可以导致一些免疫细胞的增殖和分化，具有重要的免疫调节作用。1984年，Tokunaga等[3]报道了牛分支结核杆菌（Mycobactetium Bouis，BCG）提取物中的DNA片段可增强NK细胞的活性，具有抗肿瘤效应。

本试验通过淋巴细胞增殖试验，筛选出对羊、小鼠淋巴细胞都具有较强细胞增殖作用的序列，并进行相应的动物安全性试验，为进一步开展CpG免疫增强剂免疫效力试验奠定了基础。

1 试验材料、仪器与试剂

1.1 试验仪器

厌氧手套培养箱（美国Forma Scientific公司），825A厌氧罐（沈阳第五人民医院），高速冷冻离心机ST-21（美国 Sorvall公司），96孔细胞培养板（Greiner公司）。

1.2 化学试剂[4，5，6]

限制性内切酶 EcoR1、Marker 2 000（Promega公司），EY培养基、营养肉汤培养基、TE缓冲液、质粒提取液、RPMI1640、胎牛血清（HyClone公司），淋巴细胞分离液（中国医学科学院血液研究所）。

1.3 试验动物

体重为16g～20g昆明小白鼠52只，雌、雄各半，购于长春生物制品研究所。

1.4 试验材料

1.4.1 非致病性微生物来源 CpG-DNA的设计与合成 根据CpG-DNA特性，从非致病性的4种食品酿造菌〔枯草芽孢杆菌、乳酸菌（gi：16124244）、黄色短杆菌、双歧杆菌〕基因组中找出27条CpG-DNA序列（见表1），由北京华大中生科技发展有限公司合成，聚丙烯酰氨凝胶电泳纯化，纯度＞99%，不含有脂多糖和内毒素。

1.4.2 致病性微生物来源 CpG-DNA的筛选 从节瘤拟杆菌、坏死梭杆菌基因组中找出5条富含CpGDNA的序列，分别命名为 CFNCpG1、CFNCpG2、CFNCpG3、CFNCpG4、Cp6。序列如下：

表1 CpG-DNA序列Tab.1 CpG-DNA Sequence

2 方法

2.1 含CpG-DNA序列质粒菌株的培养与质粒提取以及CpG-DNA序列片段的回收

将菌株接种于含Amp的LB液体培养基，37℃摇床培养24h。用碱裂解法提取质粒，在1%琼脂糖凝胶上进行电泳，鉴定提取结果；用EcoRI酶切质粒，1%低熔点胶回收目的片段。

2.2 淋巴细胞增殖实验

2.2.1 羊、小鼠淋巴细胞分离 羊颈静脉、小鼠去眼球无菌采血，肝素钠抗凝。取抗凝血1份，与Hank’s液1∶1混匀后，加于1份细胞于分离液面之上；1500r/min离心10min；收集界面上的细胞，放入含Hank’s液4mL试管中，充分混匀；1500r/min，离心10min；吸去上清液，沉淀洗涤2次；用无血清的RPMI-1640培养液悬浮细胞，取少量于镜下检查分离效果。

2.2.2 淋巴细胞增殖实验 细胞计数后，用RPMI-1640培养液将淋巴细胞稀释为1 106个/mL。将稀释好的淋巴细胞加入96孔培养板中，每孔加100细胞悬液。每孔加入1001640完全培养基。加入终浓度为15的CpG，同时设空白对照，混匀。37℃温箱中培养48h。细胞计数。

2.3 CpG-DNA及CpG-DNA安全性实验

免疫试验前将淋巴细胞增殖试验选出的CpG进行动物安全性试验，保证CpG实际应用时的安全。

2.3.1 质量控制 主要检测有无细菌、真菌等病原物质。

2.3.2 异常毒性试验 试验组昆明小白鼠2只，雌、雄各1只，每只小鼠腹腔注射20CpG；阴性对照组昆明小白鼠2只，雌、雄各1只，每只小鼠腹腔注射相同剂量的生理盐水，观察1周。

2.3.4 亚急性毒性试验 按给药方式将实验动物分为低剂量、中剂量、高剂量3个组及1个对照组，每组10只小鼠，雌、雄各半。3个剂量组分别于双侧后肢胫前肌肌肉注射CpG-DNA只，对照组给无菌生理盐水。每周2次，连续4周，共给药8次，每次注射体积均为以上各组于末次给药后24h摘眼球放血，处死。试验期间每日观察小鼠的外表特征和行为活动、神经症状、呼吸症状、粪便性状等，并每周测1次体重，小鼠处死后进行病理学检查。

3 试验结果

3.1 淋巴细胞增殖反应

表2 CpG序列对淋巴细胞增殖效应Tab.2 The effect of CpG sequence on lymphocyte proliferation

3.2 CpG-DNA及CpG-DNA安全性试验

3.2.1 质量控制 以无菌生理盐水稀释合成的CpGDNA及提取的质粒和酶切回收的CpG-DNA，未检出细菌、真菌等病原体。

3.2.2 CpG异常毒性实验 实验期内所有动物均未出现异常反应，实验结束后所有昆明小鼠全部健存且体重增加，说明试验用CpG无异常毒性。

3.2.3 CpG超敏反应 昆明小鼠在超敏试验过程中未出现蜷缩、抽搐、被毛立起及休克等超敏反应。

3.2.4 临床表现 试验期间各组动物活动状态、被毛体态、饮食欲未见异常。

3.2.5 病理学检查 末次给药后24h，处死并剖检小鼠，检查小鼠脏器有无异常变化。结果，试验组和对照组小鼠无明显区别，各脏器均正常。

续表2

4 讨论

自从20世纪20年代以来，研究者们均尝试以各种物质作为疫苗的佐剂从而使疫苗更有效。迄今为止，只有氢氧化铝胶佐剂被食品药品监督管理局（FDA）获准了在人类和动物疫苗中应用，但它不能诱导产生Thl型反应，且干扰细胞免疫，使得疫苗的免疫保护不全面、不持久，也存在轻度局部反应、形成肉芽肿、局部无菌性脓肿等副作用，同时，有可能对人、畜神经系统有影响等[7]。因此，研制新型的可诱导Thl型免疫反应，且安全、有效、无毒副作用的佐剂成了众多学者研究的热点。

CpG-DNA可诱导Thl型免疫应答或调节免疫应答向Thl型免疫应答转换，使机体特异性体液免疫反应增强。另外，CPG-DNA刺激淋巴细胞产生的细胞因子可作用于相同或不同类型的免疫细胞，从而组成复杂的免疫网络，并具有免疫调节作用。其免疫增强活性较氢氧化铝胶等常规佐剂高得多，既可用于灭活疫苗，也可用于活疫苗，而且与其他佐剂有强烈的协同作用，可增强一些弱抗原的免疫原性。CPG-DNA几乎作为所有蛋白质抗原和灭活疫苗的佐剂，而且在与其他佐剂合用时还可弥补其他佐剂诱导Th2性免疫应答的缺陷，此外，一些不能与铝盐佐剂混合的减毒活疫苗或多价疫苗，CpG-DNA则可作为佐剂单独使用。

本试验依据CpG-DNA特性，制备出32条CpG序列，通过淋巴细胞增殖试验筛选出4个对羊、小鼠淋巴细胞都有较强细胞增殖作用的序列，分别为L4、K13、CFNCpG3、CP6。

通过对选出的CpG进行无菌试验、超敏试验和异常毒性试验的结果初步的研究分析表明，实验筛选出的CpG-DNA无菌、无异常毒性、无超敏反应。小鼠的亚急性毒性试验结果显示，各剂量组未见明显的毒性反应，解剖检查均无明显异常，说明该试验已取得较为满意的结果，为CpG佐剂的研制与应用提供了理论依据。