免疫细胞中O-GlcNAc修饰研究进展

黄壮霖，赖贝，李岳亮，梁一



免疫细胞中O-GlcNAc修饰研究进展

黄壮霖*，赖贝*，李岳亮，梁一

523808 东莞，广东医科大学医学检验学院

蛋白翻译后修饰（post-translational modifications，PTMs）可参与蛋白的结构、活性、亚细胞定位及其整体功能的调节[1]。至今，已报道的蛋白质修饰位点超过 80 000 多个，修饰种类包括磷酸化、乙酰化、甲基化、糖基化和泛素化等，有一半以上蛋白为糖蛋白[2]。糖基化参与多种重要的生物学进程，如细胞间黏附、细胞基质的相互作用、细胞信号的转导、免疫保护、炎症、代谢调节等[3]。

1983 年，Torres 和 Hart[4]在小鼠的淋巴细胞中首次发现由 O-连接的 β-N-乙酰葡萄糖胺（O-linked β--acetylglucosamine，O-GlcNAc）修饰的糖基化形式。O-GlcNAc 是以UDP-乙酰葡萄糖胺（UDP-GlcNAc）为底物，在O-GlcNAc 转移酶（O-GlcNAc transferase，OGT）的作用下，将GlcNAc 修饰到蛋白的丝氨酸或苏氨酸残基上，并在O-GlcNAc 糖苷酶（O-GlcNAcase，OGA）的作用下去除这种修饰[5]。

与现有糖基化修饰（N-糖基化、O-糖基化）不同，O-GlcNAc 修饰具有以下特点：①GlcNAc 单糖分子不能进一步被延长或修饰成更复杂的糖结构，分子量小且不带电荷；②广泛存在于细胞质和细胞核蛋白当中，包括核孔蛋白、转录因子、RNA 结合蛋白、磷酸激酶和磷酸酶、受体蛋白、细胞骨架蛋白、代谢酶类等；③是一种动态可逆的修饰过程，由 OGT 和 OGA 控制；④与蛋白其他翻译后修饰（如磷酸化、泛素化）相互影响[6]。O-GlcNAc 糖基化修饰参与了细胞信号转导、转录调节、代谢调节、细胞骨架的构建、压力应激、细胞循环、蛋白质间的相互作用等重要的生物学功能[7]。

蛋白O-GlcNAc 修饰对其糖基供体UDP-GlcNAc 的浓度变化十分敏感。UDP-GlcNAc 是氨基己糖生物合成途径（hexosamine biosynthesis pathway，HBP）的终产物，参与HBP 的多种营养物质：谷氨酰胺、乙酰辅酶A、葡萄糖、尿苷等均能影响UDP-GlcNAc 的生物合成，从而影响蛋白的 O-GlcNAc 修饰水平[7-9]。除了对营养敏感，O-GlcNAc 信号对细胞压力如热休克、组织缺氧、营养缺乏同样有着敏感的反应。因此，O-GlcNAc 修饰作为营养和压力的感应器，可调节细胞自转录翻译到信号转导和代谢。破坏 O-GlcNAc 修饰平衡将会导致各种病理疾病，如肿瘤、糖尿病和神经退行性疾病等[10]。而免疫系统中 O-GlcNAc 修饰近年来也多有报道（表 1），本文将对各种免疫细胞中的 O-GlcNAc 修饰及其调节机制研究进展进行综述。

1 T 细胞中的 O-GlcNAc 修饰

1.1 O-GlcNAc 修饰与 T 细胞的成熟

T 细胞在胸腺中成熟，早期胸腺祖细胞为 CD4-CD8-双阴性细胞（double negative，DN），随发育阶段不同，DN 胸腺细胞分化为 DN1、DN2、DN3、DN4。DN1 细胞具有分化出 T 细胞、NK 细胞、B 细胞和巨噬细胞的异质性；从 DN2 开始发生 T 细胞受体（T cell receptor，TCR）重组；DN3 细胞开始 TCR 的 β 链与前 α 链结合成前 TCR 复合物；DN4 细胞上调 CD4 和 CD8 成为双阳性细胞（double positive，DP），并表达完整的 TCRαβ 复合物。DP 细胞通过阳性选择和阴性选择发育为成熟的 CD4+/CD8+T 细胞[11-12]。在此过程中，不同阶段的细胞会出现葡萄糖和谷氨酰胺摄入水平的动态变化，并伴随 O-GlcNAc 水平的变化。例如，DN3 胸腺细胞摄入葡萄糖和谷氨酰胺水平低，但 DN4 细胞摄入水平上调，DP 阶段又恢复低水平摄入。而蛋白 O-GlcNAc 修饰水平在 DN3 阶段上调，在 DN4 到 DP 阶段出现显著下降。在DP 细胞的阳性选择中，又出现O-GlcNAc 修饰水平的升高[11]。

表 1 免疫细胞中的 O-GlcNAc 修饰

通过 CRE 系统，敲除小鼠胸腺细胞发育不同阶段中的 OGT 基因，发现在 β 选择中 O-GlcNAc 的重要作用。在 DP 阶段之前敲除 OGT，DP 细胞数量不受影响，但不能分化出成熟的 CD4+/CD8+T 细胞[11, 13]。其中 Notch 信号通路参与调控胸腺细胞分化过程中 DN 向 DP 阶段分化的代谢改变，通过体外胸腺细胞的 OP9-DL1 系统发现，经 Notch 配体 DL1 刺激的 DN 细胞，对葡萄糖和谷氨酰胺的摄入明显增加，胞内蛋白的 O-GlcNAc 修饰水平上升[11]。

1.2 O-GlcNAc 修饰与 T 细胞的增殖、活化

T 细胞活化会诱导细胞表面表达GLUT1 和氨基酸转运体，促进葡萄糖和谷氨酰胺的吸收，加快HBP 进程，合成更多UDP-GlcNAc，在OGT 的作用下，蛋白质的O-GlcNAc 修饰有所升高[14]。

早在 1991 年，Kearse 和Hart[15]便在小鼠的 T 淋巴细胞中发现，当细胞活化之后，许多胞核蛋白的O-GlcNAc 修饰迅速升高而胞浆蛋白的O-GlcNAc 修饰却迅速减少，并在数小时后恢复正常。T 细胞活化后会表达多种细胞因子，促进 T 细胞增殖和分化[16]。其中与 O-GlcNAc 相关研究最多的是 IL-2。Huang等[17]发现经过葡萄糖胺处理的 Jurkat T 细胞，细胞中 IL-2 的水平明显降低；当敲除 Jurkat T 细胞的 OGT 后，IL-2 的表达水平降低，进而抑制 TCR 诱导的 T 细胞活化[18]；使用 OGT 抑制剂处理人原代T 细胞，可减少抗 CD3/CD28 或 PMA 所刺激的 T 细胞活化反应中 IL-2 的产生，还能抑制 T 细胞的增殖。但当T 细胞经过 OGA 抑制剂 Thiamet G 处理后，IL-2 的生成并无明显变化[19]；敲除小鼠的 OGT 基因发现，OGT 的缺失并不影响细胞毒性 T 淋巴细胞（cytotoxic lymphocyte，CTL）中 IL-2 所诱导的 STAT5 的磷酸化或 mTORC1 的活化，但会阻碍 CTL 的克隆扩增[11]。

与 IL-2 合成信号通路密切相关的转录因子主要有活化 T 细胞核因子（nuclear factor of activated T cells，NFAT）、核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）和 c-Myc[20-21]。Golks 等[18-19]在人类 T 细胞中发现，NFAT 和 NF-κB 均可被O-GlcNAc 修饰，当 TCR 受到刺激时，T 细胞胞浆中 NFAT 的O-GlcNAc 修饰会有短暂的升高，这可能与它后续的核定位有关，而 NF-κB 的O-GlcNAc 修饰则会阻碍其与 IκB 的相互作用而使 NF-κB 向细胞核迁移。c-Rel 作为 NF-κB 的亚单位，其 Ser350 可被O-GlcNAc 修饰，增强 c-Rel 与 CD28 反应原件结构域的结合，促进 IL-2 的表达[22]。c-Myc 可调节 T 细胞中营养转运体的表达，进而影响细胞中的O-GlcNAc 修饰[21, 23]。此外，c-Myc 位点 Thr58 可在糖原合成激酶 3（glycogen synthase kinase 3，GSK3）的作用下被磷酸化，促进c-Myc 的降解，使 c-Myc 在 T 细胞中的半衰期变短[21]。而 Thr58 也可发生O-GlcNAc 修饰，抑制该位点的磷酸化修饰，提高 c-Myc 蛋白的稳定性。T 细胞中的 OGT 和 OGA 对 c-Myc 的表达也有影响，使用 OGT 抑制剂之后 c-Myc 表达水平下降，相反，使用 OGA 抑制剂之后 c-Myc 表达水平上升[11]。

2016 年，Lund 等[19]使用 BEMAD、代谢标记等方法，在人的活化 T 细胞中，系统地鉴定到 214 种O-GlcNAc 修饰的糖蛋白，主要是转录因子、剪切因子、核孔蛋白等，涉及 RNA 转录、加工、运输。其中ARNT、HCLS1、ZAP-70、SHIP1、LCK、PI3K 为新鉴定的 O-GlcNAc 修饰蛋白。Lopez等[24]使用化学酶聚糖标记技术和蛋白质组学分析方法比较效应性和记忆性 CD8+T 细胞的 O-GlcNAc 修饰差别，结果发现效应性 CD8+T 细胞中的 O-GlcNAc 修饰蛋白主要参与转录和翻译进程，促进细胞的增殖，而记忆性 CD8+T 细胞中，O-GlcNAc 修饰蛋白则参与转录、翻译和 mRNA 进程中一些特殊的、更具针对性的调节。

1.3 O-GlcNAc 修饰与 T 细胞相关疾病

1.3.1 自身免疫性疾病 Th1 和Th17 细胞在多种自身免疫性疾病中均发挥着重要作用，最近的研究表明，多发性硬化病（multiple sclerosis，MS）患者体内 T 细胞中靶向调节 OGT 转录的miR-15b 表达下调，细胞内 NF-κB 的O-GlcNAc 修饰减少，进而增强了 Th17 的分化[25]。ELF-1 是 TCRζ 链基因的一种转录因子，在磷酸化修饰和O-GlcNAc 修饰的共同作用下从胞浆转移到胞核，发挥相应的功能[26]。在系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus，SLE）患者的 T 细胞中发现，ELF-1 的O-GlcNAc 修饰明显减少，下调了 TCRζ 链的表达，从而导致效应 T 细胞的功能失调[27]。

1.3.2 免疫细胞癌症 瓦博格效应（Warburg effect）是癌症的重要代谢特征，即在有氧条件下，恶性细胞糖酵解同样活跃，葡萄糖的摄入增加。这种代谢转化使营养物质在HBP 中的流通得到提高，在多种癌症细胞中均可发现O-GlcNAc 修饰水平的明显升高[28]。慢性淋巴细胞白血病（chronic lymphocytic leukemia，CLL）细胞中会表达高水平的O-GlcNAc 修饰蛋白，包括p53、AKT、MYC 等[29]。急性髓细胞白血病（acute myelocytic leukemia，AML）和CLL 细胞中的 STAT5 在第 92 位苏氨酸上可发生O-GlcNAc 修饰，使STAT5 上酪氨酸的磷酸化修饰增强，促进髓系细胞的恶性增生[30]。Swamy 等[11]在 T 细胞急性淋巴性白血病（T-cell acute lymphoblastic leukemia，T-ALL）的小鼠模型中发现，PTEN 敲除的胸腺细胞中敲除 OGT 基因可抑制细胞的恶性转化，小鼠的存活周期能够延长一半以上，但是这种小鼠中的 T 淋巴细胞与正常小鼠相比显著减少，并且不能分化为 CD4+或 CD8+的 T 细胞。从T-ALL 小鼠中分离的 T 淋巴细胞与正常的淋巴细胞相比，葡萄糖和谷氨酰胺的摄取明显升高，整体O-GlcNAc 修饰水平升高。

2 B 细胞中的 O-GlcNAc 修饰

2.1 O-GlcNAc 修饰与 B 细胞的成熟

B 细胞的发育分为两个阶段：造血干细胞在骨髓中发育为成熟 B 细胞，为中枢发育阶段；随后迁移至外周淋巴器官脾脏和淋巴结等，成熟 B 细胞经抗原刺激后增殖分化成记忆 B 细胞和浆细胞[31]。在敲除 OGT 的小鼠中发现，骨髓中成熟 B 细胞产生的频率和数量与正常小鼠相比明显减少。脾脏中 B220+B 细胞产生的频率和数量也有所减少，尤其是滤泡 B 细胞。但 OGT 的缺失对未成熟 B 细胞、过渡期 B 细胞和边缘区 B 细胞影响不大。进一步研究发现，成熟 B 细胞的减少是由于 OGT 缺失导致其发生凋亡，而不是阻断 B 细胞发育过程，因此，O-GlcNAc 修饰在维持 B 细胞自身稳态中发挥重要作用[32]。

2.2 O-GlcNAc 修饰与 B 细胞的活化

细胞膜上 CD69 的表达是 B 细胞早期活化的标志。B 细胞中 OGT 的过表达或使用 OGA 抑制剂PUGNAc 均可上调 B 细胞膜上的 CD69 的表达[18]。另外，使用更具特异性的 OGA 抑制剂 thiamet-G 处理 B 细胞或敲除 B 细胞 OGA 基因，会促进 B 细胞的活化，但也导致 B 细胞的凋亡。进一步研究发现，淋巴细胞特异性蛋白（lymphocyte specific protein-1，LSP1）在其 Ser209 的 O-GlcNAc 修饰可使 Ser243 发生磷酸化修饰，启动凋亡进程[33]。

与 T 细胞的活化类似，B 细胞受体（B cell receptor，BCR）受到刺激之后，转录因子 NFAT 和 NF-κB被 O-GlcNAc 修饰之后影响其各自的核定位，进而影响 B 细胞的活化[34]。Golks 等[18]发现，OGT 的过表达或使用 OGA 抑制剂 PUGNAc 可通过上调 NF-κB 的 O-GlcNAc 修饰水平，提高 B 细胞中 BCR 依赖的 NF-κB 活性，进而促进 B 细胞的活化。

另外，与 B 细胞活化中的 O-GlcNAc 修饰相关的因子还包括：CD79a/79b、激酶 Syk、Lyn、Btk[35]、B 细胞活化因子受体（B-cell activating factor receptor，BAFFR）[36]等。在 OGT 缺失的小鼠中发现，经 IgM抗体刺激的小鼠脾脏 B 细胞，其 CD79a、Lyn、Syk 的磷酸化修饰均有所减少，NF-κB 多种亚单位的核定位也随之减少[32]。BAFFR 是 B 细胞活化过程重要分子，可通过 Src 激酶 Lyn 的活化，使 CD79a 和 Syk 发生磷酸化修饰，从而与 BCR 信号通路共同调节 B 细胞动态平衡[36]。研究发现，Lyn 在 S19 位点上的 O-GlcNAc 修饰可以促进 Lyn 的活化，并招募 Syk 与之相互作用[32]。

2.3 O-GlcNAc 修饰与 B 细胞相关疾病

前 B 细胞急性淋巴细胞性白血病（pre-B acute lymphocytic leukemia，pre-B-ALL）患者骨髓CD19+的单个核细胞中，O-GlcNAc 修饰水平明显升高，OGT 升高，OGA 减少，PI3K/Akt/c-Myc 通路过度活化。当细胞中的 OGT 缺失时，PI3K 和磷酸化的 Akt、c-Myc 均减少，说明 OGT 可能参与 PI3K/Akt/c-Myc 通路的活化[37]。在CLL 细胞中发现，Syk 磷酸化水平升高，会伴随着蛋白 O-GlcNAc 修饰水平的升高[29]。弥漫性大 B 细胞淋巴瘤（diffuse large B-cell lymphoma，DLBCL）患者的 B 细胞中，OGT 的 mRNA 表达水平明显升高[38]。

3 巨噬细胞中的 O-GlcNAc 修饰

巨噬细胞在固有免疫反应、组织细胞的内稳态和发展、促炎性反应和噬菌/吞噬作用中均发挥着重要的作用[39]。小神经胶质细胞为定居脑内的巨噬细胞，调节神经中枢的固有免疫反应。LPS 可诱导小神经胶质细胞中 c-Rel 的活化，提高 c-Rel 与 OGT、p50 的相互作用，c-Rel 的 O-GlcNAc 修饰增加，与 NF-κB 结合增强，促进诱生型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）的产生[40]。小鼠巨噬细胞 RAW264.7 中，OGT 与 mSin3a 的相互作用，会干扰 LPS 诱导的 NF-κB 活化和 iNOS 基因的表达[41]。虽然 p65 与 c-Rel 同为 NF-κB 家族的成员，但对 O-GlcNAc 修饰的反应却有所不同，thiamet-G 可促进小神经胶质细胞中 p65 的 O-GlcNAc 修饰，使其与 IκB 结合，影响 p65 的核定位，抑制促炎因子的表达和细胞的分化[42]。此外，在高糖条件下，葡萄糖胺抑制 LPS 诱导的 RAW264.7 细胞中 NF-κB 的活化，c-Rel 的 O-GlcNAc 修饰减少，而在低糖条件下，葡萄糖胺可使 c-Rel 的 O-GlcNAc 修饰增加，促进其与iNOS 启动子的结合[43]。

STAT 信号通路在炎症反应和肿瘤的发生中发挥着重要作用，在小鼠的骨髓源性巨噬细胞中发现，STAT3 的 717 位苏氨酸可被 O-GlcNAc 修饰，进而下调 STAT3 的磷酸化修饰和 STAT3 依赖的相关基因表达。E3 泛素连接酶CUL3 可下调 OGT 的表达，主要是通过抑制核因子 E2 相关因子 2（nuclear factor E2-related factor-2，NRF2）与 OGT 启动子的结合，抑制 STAT3 的 O-GlcNAc 修饰[44]。

从上述的研究中可以发现，巨噬细胞中的 O-GlcNAc 修饰对炎症反应有着正性调节和负性调节的作用，这可能与细胞对葡萄糖的利用、细胞所处的炎症微环境以及 NF-κB 和 STAT 信号通路中多种关键调节分子的 O-GlcNAc 修饰密切相关。

4 中性粒细胞中的 O-GlcNAc 修饰

中性粒细胞在固有免疫中可通过噬菌作用和分泌多种抗菌因子抵御细菌的感染，是机体发生损伤和感染时最先响应的细胞。Kneass 和 Marchase[45]发现，从健康人全血分离的中性粒细胞在趋化肽甲酰化甲硫氨酸-亮氨酸-苯丙氨酸（formylated Met-Leu-Phe，fMLF）的刺激下，蛋白质的 O-GlcNAc 修饰发生迅速而短暂的升高，在细胞的信号传导中起到重要作用。当中性粒细胞经过葡萄糖胺或 PUGNAc 的处理之后，O-GlcNAc 修饰水平的升高不仅能提高中性粒细胞的能动性，而且能增强丝裂原蛋白激酶 p38、p44/42、MKK3/6 和MEK1/2 的活性。此外，多种细胞信号通路蛋白包括 PI3K、Rho 家族的 GTP 酶、Rac 和 ERK1/ERK2 均与中性粒细胞中的 O-GlcNAc 修饰有关[46]。在一项创伤-出血的小鼠模型中发现，经过葡萄糖胺或 PUGNAc 处理之后，作为中性粒细胞浸润标志的骨髓过氧化物酶，与对照组相比明显降低[47]。但中性粒细胞中 O-GlcNAc 修饰蛋白的鉴定工作尚未有报道。

5 NK 细胞中的 O-GlcNAc 修饰

NK 细胞是一种细胞毒性淋巴细胞，参与细胞的固有免疫和适应性免疫。Yao 等[48]发现，NK 细胞中的 O-GlcNAc 修饰可通过影响 NK 细胞的信号传导减弱其细胞毒性，而GST-sHLA-G1α 链可抑制 NK 细胞中 O-GlcNAc 修饰水平。EZH2 是一种组蛋白甲基转移酶，当其活性受抑制时，不仅能够加快 NK 细胞的成熟，还能提高 NK 细胞杀伤功能，在 EZH2 上已鉴定到 5 个 O-GlcNAc 修饰位点，对该蛋白的稳定和功能均有重要作用[49-51]。

6 总结与展望

过去 30 多年间的研究表明，O-GlcNAc 修饰与多种疾病，如糖尿病、癌症、神经退行性疾病、心血管疾病等关系密切。在动物模型中，OGT 和（或）OGA 的缺失都有致死性。O-GlcNAc 糖基化的动态修饰与免疫代谢的调节密切相关，影响免疫细胞的增殖、分化、成熟、活化、肿瘤发生等。但免疫细胞中的 O-GlcNAc 修饰相关研究相较于其他疾病依然较少，主要集中在对 T 细胞的研究。许多参与固有免疫和适应性免疫信号调节的关键分子，包括 NOD2、TAB1、CaMKIV 等均被 O-GlcNAc 修饰，但这些蛋白在免疫细胞中与 O-GlcNAc 修饰相关机制研究数据很少。长期以来，对 O-GlcNAc 修饰的研究进展一直很慢，主要有以下几方面：①对于胞核胞浆组分中的糖基化修饰仍未有一个统一的标准；②O-GlcNAc 修饰作为一种单糖修饰，分子量小且不带电荷，它的添加和移除在 SDS-PAGE 上并不会有明显的迁移，也成为鉴定位点工作的技术瓶颈；③细胞中存在高水平的水解酶，当细胞受损或被裂解时，O-GlcNAc 修饰容易被移除；④O-GlcNAc 多位点修饰鉴定的技术难题。近年，随着检测 O-GlcNAc 修饰单克隆抗体的发展，“点击化学”的应用，更精密的质谱技术（如 HCD、ETD）的研发，使得对 O-GlcNAc 修饰的研究能够突破技术的瓶颈。在未来的研究中，将会帮助我们理解 O-GlcNAc 修饰在免疫细胞中的作用机制。

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*同为第一作者

10.3969/j.issn.1673-713X.2018.06.012

国家自然科学基金（81102850）；广东医科大学医学检验学院创新团队项目（201703）

梁一，Email：liangyigdmu@163.com

2018-09-23