高产花生四烯酸的高山被孢霉菌株发酵条件优化

顾晓颖，王文思，陈 家，赵丹丹，李凌飞*

(1.云南农业大学食品科学技术学院，云南昆明 650201;2.云南省农业科学院农业经济与信息研究所，云南昆明 650205)

【研究意义】花生四烯酸(Arachidonic acid，ARA或 AA)，即全顺-5，8，11，14-二十碳四烯酸，属于 ω-6系列PUFAs，是人体三大必需脂肪酸之一，具有卓越的药用价值和营养保健功能，目前已广泛应用于医药、食品、饲料等领域［1］。传统来源的ARA非常有限，还需面对资源枯竭、环境污染和提取成本高等现实问题［2］，已无法满足日益增长的市场需求。微生物发酵生产ARA可以克服传统来源的缺点，是制备ARA的新途径［3］。高山被孢霉(Mortierlla alpina)是发酵生产ARA的商业菌株，其菌丝中含有大量PUFAs，以ARA为主，占 PUFAs总量的68.5% ～78.8%［4］。此外，安全性评估认定 M.alpina及其发酵产品是安全可食用的［5］。优化发酵条件是提高M.alpina ARA产量最简单有效的方法，但菌株间的差异导致最佳发酵条件普适性差。因此，优化发酵条件仍是目前M.alpina的研究热点，亦是M.alpina高产ARA的瓶颈。【前人研究进展】M.alpina生长可用碳源有葡萄糖、木糖、乳糖、可溶性淀粉、蔗糖、甘油等，可用有机氮源有尿素、豆粕粉、酵母浸粉等，可用无机氮源有硝酸钾、硝酸钠、硫酸铵、氯化铵等。一些研究对M.alpina的培养基及发酵条件进行了优化，菌体生物量和ARA产量都有不同程度的提高［6－8］。【本研究切入点】生物量的积累是以养分的吸收为基础的，其能反映养分的吸收状况［9］。ARA属于M.alpina的胞内代谢物，生物量和ARA产量密切相关，项目前期研究结果，M.alpina菌丝中ARA含量与菌体生物量呈显著正相关(r=0.609，n=180，P ＜0.001)。本试验以前期筛选出的3株ARA高产菌株为对象，以菌体生物量为主要考核指标，对M.alpina的发酵条件进行优化研究。【拟解决的关键问题】以期获得较高的菌体生物量和ARA产量，为利用M.alpina工业化生产ARA奠定基础。

1 材料与方法

1.1 菌种

高山被孢霉(M.alpina):项目前期筛选出的3株高产ARA的菌株(D1、N24和11f01)。

1.2 培养基

斜面培养基:PDA培养基;种子培养基:葡萄糖30 g/L，酵母提取物 6 g/L，KH2PO43 g/L，NaNO33 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，pH 自然;基础发酵培养基:葡萄糖80 g/L，酵母提取物11 g/L，KH2PO43.8 g/L，NaNO33.4 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，pH 自然。

以上培养基均经过121℃灭菌20 min。

1.3 培养方法

1.3.1 菌种活化 将常温石蜡油封存的菌株转接于PDA斜面培养基，室温培养7 d。

1.3.2 种子培养 挑取少量活化后的菌丝于装有50 mL种子培养基的250 mL三角瓶中，150 r/min，25℃摇瓶培养3 d。

1.3.3 发酵培养 从种子培养液中挑取10～15个直径为1～2 mm的菌球，接种于装有100 mL发酵培养基的500 mL三角瓶中，25℃，150 r/min培养7 d，每个样做3个重复。

1.3.4 碳源种类优化 控制基础发酵培养基其他条件不变，分别以葡萄糖80 g/L、乳糖80 g/L、蔗糖80 g/L为碳源进行单因素实验。

1.3.5 氮源种类优化 在确定最佳碳源基础上，分别以酵母浸粉、NaNO3、(NH4)2SO4、KNO3、NH4NO3、NH4Cl(按相同总氮量计算)为氮源进行单因素实验。

1.3.6 发酵培养基的优化 根据优化出的最佳碳氮源种类，按表1设计4因素3水平正交试验。

1.3.7 生长温度优化 最佳培养基配方确定后，分别于15、20、25、30 ℃条件下发酵 M.alpina以确定最佳生长温度。

1.4 实验方法

1.4.1 菌体生物量的测定 将发酵获得的菌丝体真空抽滤后，用去离子水洗涤菌体3次，菌体置－20℃预冻过夜后真空冷冻干燥3 d，测得菌体生物量(干重)。

1.4.2 ARA含量分析 准确称取50 mg干菌体粉末于具盖试管中，加入1 mL甲苯，2 mL 1%的硫酸甲醇，1 mL C17∶0正己烷标样(浓度为 1 mg/mL;十七烷酸标品纯度为99%，购自Sigma公司)，混匀后置于50℃水浴过夜。冷却后加入5%NaCl水溶液，混匀后加入正己烷萃取2次，合并上清液(正己烷)。再加入2%KHCO3水溶液清洗，收集上清液氮气吹干。获得的脂质复溶于1 mL含0.05%BHT的正己烷溶液中，过滤后待测。

采用气相色谱-质谱连用仪(GC-MS)进行脂肪酸的定性和定量分析(安捷伦5975C-7890A)。设置参数:色谱柱Hp-5Max(30 m×0.25 mm)，载气为氦气，流速1 mL/min;色谱条件:进样口温度为250℃，分流进样，进样体积 1 μl，分流比 50∶1，柱起始温度80℃，保持3 min，然后以20℃/min升至180℃，保持1 min，再以1℃/min升至210℃保持5 min，最后以5℃/min升至240℃保持8 min。按照标准谱库对菌体中脂肪酸进行定性分析，以C17∶0为参照内标，根据峰面积对ARA进行定量分析。

表1 L9(34)正交优化设计Table 1 Orthogonal design

表2 高山被孢霉菌丝中脂肪酸含量Table 2 Fatty acid contents in mycelia of M.alpina

1.4.3 统计分析 利用SPSS 19.0统计软件对同一菌株不同碳源/氮源之间，以及同种碳源/氮源不同菌株之间的菌体生物量进行单因素方差分析，并进一步采用SNK法进行两两比较。

2 结果与分析

2.1 3株高产ARA的高山被孢霉菌株脂肪酸含量分析

如表2所示，3株M.alpina菌丝中均含大量脂肪酸，总脂肪酸含量可达菌丝干重的45%，且所含脂肪酸种类丰富，组成合理。菌丝中脂肪酸包括饱和脂肪酸、单不饱和脂肪酸和多不饱和脂肪酸。单不饱和脂肪酸主要为 C16∶0和 C18∶0，是合成各个不饱和脂肪酸的前体;单不饱和脂肪酸作为PUFAs合成过程的中间体，主要以 C18∶1为主;PUFAs(C18∶2，C18∶3，C20∶3和 C20∶4) 是菌丝中的主要脂肪酸种类，其含量可高达总脂肪酸含量的50%，而 ARA(即C20∶4)作为主要的 PUFAs，在 D1、N24 和 llf01 菌丝中分别为 141.39、152.01 和 111.71 mg/g，在 PUFAs中所占比例可达64%。

图1 不同碳源对高山被孢霉菌体生物量的影响Fig.1 Effect of different carbon sources on the biomass of M.alpina

表3 不同碳源发酵时高山被孢霉菌体生物量的单因素方差分析Table 3 One-way ANOVA of the biomass of M.alpina with different carbon sources

2.2 3种碳源对3株高山被孢霉菌体生物量的影响

3株菌的最佳碳源均为葡萄糖(图1)，同一菌株3种碳源发酵时菌体生物量统计分析的结果表明，3种碳源对每株菌的生物量均有显著影响(表3)。D1菌株以葡萄糖为碳源时，所获生物量显著高于蔗糖，且蔗糖显著大于乳糖;N24菌株与11f01菌株一样，以葡萄糖为碳源，所获生物量显著大于蔗糖和乳糖，但蔗糖和乳糖间无显著差异(图1)。同一种碳源3个菌株之间生物量的统计分析结果表明，每一种碳源对3株菌的生物量也都具有显著影响(表3)。以葡萄糖为碳源，D1和N24菌株的生物量显著高于11f01;以蔗糖为碳源，N24和llf01生物量显著高于D1菌株;而以乳糖为碳源，N24生物量显著高于llf01，且llf01显著高于D1(图1)。

图2 不同氮源对M.alpina生物量的影响Fig.2 Effect of different nitrogen sources on the biomass of M.alpina

表4 不同氮源发酵时M.alpina生物量的单因素方差分析Table 4 One-way ANOVA of the biomass of M.alpina with different nitrogen sources

2.3 6种氮源对3株高山被孢霉菌体生物量的影响

3株菌的最佳氮源均为酵母浸粉(图2)，同一菌株6种氮源发酵时菌体生物量统计分析表明:6种氮源对每株菌的生物量均有显著影响(表4)，D1菌株以酵母浸粉为氮源时，其生物量显著高于硝酸铵，硝酸铵显著高于硝酸钾、硫酸铵、氯化铵，以硝酸钠为氮源时生物量最低;N24菌株以酵母浸粉为氮源时其生物量显著高于硝酸铵，硝酸铵显著高于硝酸钠、硝酸钾、硫酸铵(后3种氮源所获生物量无显著差异)，以氯化铵为氮源时生物量最低;11f01菌株以酵母浸粉为氮源所获生物量最高，其次为硝酸铵，硝酸钾和氯化铵无显著差异，以硝酸钠为氮源时生物量最低(图2)。同一种氮源3个菌株之间生物量的统计分析结果表明，每一种氮源对3株菌的生物量均有显著影响(表4)，以酵母浸粉为氮源，N24菌株生物量显著大于D1，且D1显著大于llf01;以硝酸钠和硫酸铵为氮源，3株菌生物量无统计学差异;以硝酸钾和氯化铵为氮源，llf01菌株生物量显著大于D1和N24;以硝酸铵为氮源，D1菌株生物量显著大于N24，且N24显著大于llf01(图2)。

2.4 培养基的优化

上述单因素实验结果表明，不同碳、氮源对M.alpina菌体生长有较大影响。据报道，KH2PO4浓度及发酵液初始pH值对菌株生长也有较大影响，因此本试验在上述最佳碳源葡萄糖、最佳氮源酵母浸粉的基础上，再选取初始pH值及KH2PO4进行L9(34)正交试验。

2.4.1 D1菌株的培养基优化 表5为D1菌株培养基优化L9(34)正交实验结果。数据分析显示:4个因素对D1菌株生物量影响大小依次为酵母浸粉＞KH2PO4＞初始 pH值 ＞葡萄糖。最佳组合为A2B1C2D3，即D1菌株的最佳培养基配方:葡萄糖120 g/L;KH2PO41 g/L;酵母浸粉15 g/L;初始pH 5.5。其中葡萄糖浓度为基础培养基的1.5倍，KH2PO4浓度由原先的3.8下降至1。

2.4.2 N24菌株的培养基优化 表6为N24菌株培养基优化L9(34)正交实验结果。数据分析显示:4个因素对N24菌株生物量影响大小依次为初始pH值＞酵母浸粉＞KH2PO4＞葡萄糖。最佳组合为A2B1C3D2，即N24菌株的最佳培养基配方:葡萄糖120 g/L;KH2PO41 g/L;酵母浸粉20 g/L;初始pH6.0。于最优配方条件下发酵M.alpina进行验证，所获菌体生物量为26.70 g/L，相比表6中最高值(25.96 g/L)提高了 2.9%。

表5 D1菌株培养基优化L9(34)正交实验Table 5 The orthogonal experiment L9(34)for optimization of culture medium of D1 strain

表6 N24菌株培养基优化L9(34)正交实验Table 6 The orthogonal experiment L9(34)for optimization of culture medium of N24 strain

2.4.3 11f01菌株的培养基优化 表7为11f01菌株培养基优化L9(34)正交实验数据和结果。数据分析显示:4个因素对11f01菌株生物量影响大小依次为KH2PO4＞酵母浸粉＞初始pH值＞葡萄糖。最佳组合为A2B1C2D2，即11f01菌株的最佳培养基配方:葡萄糖120 g/L;KH2PO41 g/L;酵母浸粉15 g/L;初始pH 6.0。于最优配方条件下发酵M.alpina进行验证，所获菌体生物量为22.20 g/L，相比表7中最高值(21.30 g/L)提高了4.2%。

2.5 发酵温度优化

基于上述最优培养基配方，于不同温度下发酵M.alpina。结果表明发酵温度对菌株生物量影响显著。各菌株的生物量均随温度的升高呈现先升高后降低的趋势，不同温度所获生物量大小顺序为20℃ ＞25℃ ＞15℃ ＞30℃(图3)。统计分析结果表明，同一温度下，3株菌的生物量均有显著差异(P值均小于0.001，表8)。同一温度下不同菌株的生物量方差分析结果表明，当温度为15、20和25℃，D1、N24菌株生物量均显著大于llf01;而温度为30℃时，3株菌的生物量无统计学差异(图3，表8)。

表7 11f01菌株培养基优化L9(34)正交实验Table 7 The orthogonal experiment L9(34)for optimization of culture medium of 11f01 strain

图3 不同温度对M.alpina菌体生物量的影响Fig.3 Effect of different temperature on the biomass of M.alpina

2.6 最优发酵条件验证

于最优条件下发酵M.alpina，3株菌的生物量均与模型理论值接近。D1菌株生物量由21.86 g/L增加至26.67 g/L，增加了22.0%;N24菌株生物量由 23.46 g/L 增加至 27.07 g/L，增加了 15.39%;11f01菌株生物量由18.75 g/L增加至23.20 g/L，增加了23.73%。

GC-MS测定脂肪酸含量，3株菌菌丝中ARA产量变化如下:D1菌株ARA产量由3.09 g/L增至4.29 g/L，增长率为38.79%;N24菌株ARA产量由3.57 g/L 增至 4.39 g/L，增长率为 23.16%;11f01菌株ARA产量由 2.09 g/L增至3.45 g/L，增长率为 64.59%。

3 讨论

3.1 碳源对高山被孢霉菌体生物量的影响

霉菌可利用的碳源很多，如葡萄糖、蔗糖、乳糖、淀粉糖化液、糖蜜、果糖等。本研究结果表明M.alpina生长的最适碳源为葡萄糖，此结果与Nisha［10］和 Chatzifragkou［11］的研究结果一致。M.alpina 能较好地利用葡萄糖而非其他碳源进行菌丝增殖生长，其原因可能是葡萄糖相比其他碳源更易被直接利用，这增加了菌株对葡萄糖的同化效率以至获得更高的菌体生物量。

3株菌发酵生产的最适葡萄糖浓度均为120 g/L。当葡萄糖浓度过高时(160 g/L)，培养液渗透压增大，粘度升高，不利于氧气和营养物质的传递;当葡萄糖浓度过低时(80 g/L)，细胞生长可能受到抑制过早进入衰退期。

3.2 氮源对高山被孢霉菌体生物量的影响

氮源分为无机氮源和有机氮源，不同种类和不同浓度的氮源都能影响代谢产物合成的方向和产量［8］。Lu［12］等在不同氮源条件下发酵 M.alpina，发现以酵母提取物为氮源时，获得最高生物量和总脂肪酸产量，以硝酸钠为氮源有利于ARA积累，但所获生物量较低。M.alpina可利用的氮源有硝酸盐、铵盐、豆粕粉、氨基酸、酵母浸粉、尿素等。本研究结果表明酵母浸粉是发酵M.alpina的最适氮源，此结果与一些研究一致［13－14］，其原因可能是酵母浸粉作为较复杂的有机氮源，其不仅为M.alpina的生长提供氮元素，还可能提供维生素、无机盐等微量元素。

表8 不同温度发酵时高山被孢霉菌体生物量的单因素方差分析Table 8 One-way ANOVA of the biomass of M.alpina with different temperature

3.3 KH2PO4对高山被孢霉菌体生物量的影响

矿物盐主要影响细胞壁的电荷，会造成菌丝形态的改变［15］，而菌丝形态与菌株生长状况密切相关。Higashiyama［16］等研究了矿物盐对ARA产量的影响，发现当培养基中含有Na2SO4、CaCl2、MgCl2而无KH2PO4时，主要菌体形态成2～3 mm的大球型，颗粒壁的传质限制导致菌球中心菌丝的自溶，生物量降低。这可能是因为菌株能利用KH2PO4中的磷合成结构组织和大量聚合磷酸盐。本研究选择了3个 KH2PO4浓度(1、3、5 g/L)对培养基进行优化，结果表明3株菌均是KH2PO41 g/L为最佳浓度。范益春［17］等发现在磷限制条件下发酵 M.alpina，发酵周期缩短、生物量和总脂肪酸含量增加，这进一步验证了本研究结果。

3.4 初始pH对高山被孢霉菌体生物量的影响

发酵pH对M.alpina的生长具有较大影响。郑志达［18］等研究发现在pH 6.0时所获菌体生物量最大，其次为pH 5.5，pH对油脂中ARA比例无影响，弱酸性有利于菌株生长和油脂积累。邓中涛［19］等研究发现在pH 5.5～6.5时所获菌株生物量和油脂含量差异不显著，当pH 7.5时会抑制菌株对葡萄糖的吸收，菌体生物量和油脂含量最低，弱酸性有利于菌株生长和油脂积累。Li［20］等的研究认为pH为5.5时有利于菌株生长，而pH 6.5时有利于油脂的积累。本研究的结果表明，pH 5.5或pH 6.0是菌株生长的最适pH，不同菌株间的最佳pH值存在细微差别。

3.5 温度对高山被孢霉菌体生物量的影响

一些研究表明低温能促进产油微生物积累更多的PUFA，但会抑制微生物的生长。本研究结果20℃是M.alpina生长的最适发酵温度。当发酵温度低于20℃时，菌丝生长受到抑制。其原因可能是较低温度不利于菌株吸收利用葡萄糖，导致整个发酵过程中菌株生长缓慢;此外，菌株在低温条件下存在更长的延滞期，这也是生物量降低的因素之一［21］。M.alpina生长是一个高需氧的过程，发酵液溶氧能力会随着温度的升高缓慢降低，当温度达到25℃或高于25℃时，发酵液中低的溶氧量会抑制菌株生长，导致菌体生物量降低。

3.6 优化后获得的M.alpina生物量与ARA产量

在本研究中，优化后3株M.alpina菌株的生物量分别为 26.67、27.07 和 23.02 g/L，增幅达 22.0%、15.39% 和 23.73%;ARA 含量分别为 4.29、4.39 和 3.45 g/L，增幅达 38.79%、23.16% 和64.59%。与有些研究相比，生物量和ARA含量增加幅度不高［6－7］，其原因主要是这 3株菌株是从151株菌中筛选出的高产ARA的菌株，生物量和ARA含量提升的空间有限。沈以凌［8］等对M.alpina发酵生产ARA的培养基配方及发酵条件进行优化，获得较高的菌体生物量和ARA产量，分别为26.95和4.86 g/L，本研究优化后 M.alpina的生物量和ARA含量与之相当。

4 结论

通过研究M.alpina的发酵条件，发现碳源、氮源、KH2PO4、pH值、发酵温度均对菌体生物量有重要影响。M.alpina发酵的最佳碳源为葡萄糖，最佳氮源为酵母浸粉，较低浓度的KH2PO4和弱酸性(pH 5.5～6.0)有利于菌株生长，最适发酵温度为20℃。3株菌的最佳发酵培养基配方仅酵母浸粉和pH值存在细微差别。通过发酵条件的优化，3株菌的菌体生物量和ARA含量均有明显提高。