基于无缝克隆方法构建毛木耳多功能纤维素酶基因农杆菌转化载体

贾定洪，李小林，周 洁，彭卫红，谭 伟，黄忠乾，甘炳成

(四川省农业科学院土壤肥料研究所，四川成都 610066)

【研究意义】纤维素分解为葡萄糖至少需要3种纤维素酶，包括内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶及β-葡萄糖苷酶。而福寿螺(Ampullaria crossean)胃组织分离的纤维素酶基因(multi-functional cellulase gene，Mfc)能够编码内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶及β-葡萄糖苷酶这三种纤维素酶［1］，是一种多功能纤维素酶，应用前景看好。而毛木耳是一种木腐真菌，其纤维素降解等能力是生物转化率的酶学基础，是毛木耳实现高产的重要保证。但是独立的酶基因无法启动其自身表达，只有适合于宿主的启动子、基因及终止子的适当组合，才能够启动目标基因表达，考察其对宿主性状的作用。因此，通过宿主启动子的克隆、目标基因密码子优化及终止子的正确组装，将是实现多功能纤维素酶基因Mfc在毛木耳细胞中表达和改良菌株纤维素降解能力的必要前提。【前人研究进展】目前多功能纤维素酶基因Mfc已在灰盖鬼伞［2］和草菇［3］等食用菌进行了转化研究。但Mfc基因来源于福寿螺组织，在毛木耳细胞中不一定能够稳定高效表达。为了将该基因改造成为具有毛木耳物种偏好性［4］的编码序列，以免影响基因的蛋白翻译［5］，前期实验中贾定洪已将多功能纤维素酶基因Mfc改造为具备毛木耳密码子偏好性的基因Mfcsg［6］，为该基因在毛木耳细胞中表达奠定了基础。【本研究切入点】实验通过毛木耳Gpd启动子、内含子intron及改造型Mfcsg基因克隆，将之与pPK2质粒EcoRI酶切大片段进行无缝克隆，分别构建农杆菌转化载体pAKMFC、pAKIMFC，为多功能纤维素酶基因Mfc在毛木耳细胞中转化表达和种性改良奠定基础。【拟解决的关键问题】组装形成Mfcsg基因表达盒，构建该基因启动子、目的基因及终止子转化质粒，为多功能纤维素酶基因Mfcsg在毛木耳细胞转化表达提供具有自主知识产权的转化质粒。

1 材料与方法

1.1 材料与质粒

pPK2质粒购自杭州工道生物技术有限公司。DH5(感受态细胞购自上海超研生物科技有限公司。ClonExpress MultiS多片段无缝克隆试剂盒购自南京诺唯赞生物科技有限公司，其它试剂购自生工生物工程上海(股份)有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 转化载体pAKMFC构建 EcoRⅠ酶切质粒pPK2，回收大片段，应用引物对1Fakmfc/1Rakmfc、Mfcfakmfc/Mfcrakmfc、CFakmfc/CRakmfc 分别扩增毛木耳Gpd启动子、Mfcsg基因、Hpt部分基因(引物见表1)，按照ClonExpress MultiS多片段无缝克隆试剂盒方法一步克隆获得农杆菌转化载体pAKMFC［7］。

1.2.2 转化载体 pAKIMFC构建 EcoRⅠ酶切pPK2质粒，回收大片段，应用引物对 1Fakimfc/1Rakimfc、AFakimfc/ARakimfc、Mfcfakimfc/Mfcrakimfc、CFakimfc/CRakimfc分别扩增毛木耳 Gpd启动子、intron、Mfcsg基因、Hpt部分基因(引物见表 2)，按照1.2.1方法构建农杆菌转化载体pAKIMFC。

1.2.3 转化载体pAKMFC、pAKIMFC测序验证pAKMFC、pAKIMFC质粒构建后热激转化到 DH5(感受态细胞，挑选阳性克隆送生工生物工程上海(股份)有限公司测序，测序引物为 pPK2f(5’-CTAGCCAATACGCAAACCGC-3’)和 pPK2r(5’-CTTAGTAGGAATGATTTTCG-3’)，该引物可以扩增pAKMFC、pAKIMFC改造区DNA序列。

表1 pAKMFC载体构建引物序列表Table 1 Primer sets used for the plasmid construction of pAKMFC

表2 pAKIMFC载体构建引物序列表Table 2 Primer sets used for the plasmid construction of pAKIMFC

图1 pAKMFC质粒测序验证图Fig.1 pAKMFC plasmid validated by sequencing

2 结果与分析

2.1 转化载体pAKMFC测序验证

将质粒pAKMFC测序获得的序列与目标序列比对，发现改造获得的质粒与目标设计序列完全一致，改造后的质粒中Gpd启动子、Mfcsg基因、Hpt基因构件完整、准确，达到了实验预期(图1)。将测序序列与pPK2质粒大片段拼接后获得pAKMFC质粒图谱(图2)

2.2 转化载体pAKIMFC测序验证

将质粒pAKIMFC测序获得的序列与目标序列比对，发现改造获得的质粒与目标设计序列完全一致，改造后的质粒中Gpd启动子、intron、Mfcsg基因、Hpt基因构件完整、准确，达到了实验预期(图3)。将测序序列与pPK2质粒大片段拼接后获得pAKMFC质粒图谱(图4)。

3 讨论

图2 pAKMFC质粒图谱Fig.2 Plasmid profile of pAKMFC

图4 pAKIMFC质粒图谱Fig.4 Plasmid profile of pAKIMFC

表达元件的正确组装是目的基因有效表达的前提。采用合适的启动子、适合于宿主密码子偏好性的基因序列及有效终止子，将促进目标基因高效表达。本实验采用毛木耳Gpd启动子、具备毛木耳密码子偏好性的多功能纤维素酶基因、潮霉素B抗性基因及构巢曲霉终止子，构建了较为理想的适合于毛木耳表达的多功能纤维素酶表达盒。实验共设计构建了2个农杆菌转化质粒pAKMFC和pAKIMFC，它们之间区别在于pAKIMFC是在pAKMFC的启动子与表达基因之间插入了一段pPK2质粒原有的内含子GpdA，目的在于考察内含子对于基因表达的影响。实验构建形成了适合于农杆菌介导转化毛木耳应用的改造型多功能纤维素酶基因Mfcsg双元表达质粒pAKMFC和pAKIMFC，并且已成功用农杆菌AGL1::pAKMFC和AGL1::pAKIMFC转化毛木耳，提高了毛木耳菌丝的吃料能力(结果另文发表)，该研究为农杆菌介导的多功能纤维素酶Mfcsg基因转化改良毛木耳奠定了基础。