辽东栎橡碗单宁提取及其抗氧化活性

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(西北农林科技大学林学院,陕西咸阳 712100)

辽东栎(Quercusliaotungensis)作为黄土高原地带性植被建群种及桥山林区主要成林树种之一,对维持当地生态系统平衡起着重要作用[1-2]。除具有较高生态价值外,张娜等[3]研究指出辽东栎不同器官均含有植物多酚单宁,新鲜叶片中单宁含量可达206.74 mg/g。植物多酚由于富含酚羟基,可贡献氢原子或电子进而表现出抗氧化活性[4-5]。不同植物以及同种植物不同器官中的植物多酚化学结构及聚合方式可能不同,进而导致其反应活性及用途也各不相同。槭属植物红枫和糖槭单宁具有抗氧化,抗糖尿病及α-糖苷酶抑制作用[6]。美丽白千层(Melaleucastyphelioides)鞣花单宁具有抗氧化及护肝活性[7];富含鞣花单宁的红树莓提取物除具有抗氧化活性外[8],还可以改善老年大鼠的运动功能[9]。高粱中缩合单宁可降血糖[10],松树皮单宁作为添加剂,可增强塑料的抗紫外辐射能力[11]。

由于单宁是由不同分子量、不同极性的酚类组成的混合物,蒸馏水及纯溶剂提取效率常不理想,在实际操作中多选用乙醇、丙酮等有机溶剂的水溶液作为提取剂。超声波的空化作用可形成高温高压,迅速破坏植物细胞壁同时不影响被提取有效成分的化学结构。为了进一步提高提取效率,实际操作中多结合超声波作为辅助提取[12-14]。Rhazi Naima等[15]、张志健等[16]研究结果均表明,超声辅助可大大提高单宁提取效率。目前,有关栎类单宁的研究主要集中在提取工艺的优化,尹艺凝等[17]对四种类型栓皮栎不同器官单宁含量研究发现,栓皮栎不同器官以橡碗单宁含量最高。薛文艳等[18]对桥山林区麻栎橡子单宁提取工艺进行了响应面优化并提出了最佳提取工艺,并对提取的麻栎橡子单宁进行了抗氧化活性分析,但目前未见关于辽东栎单宁提取工艺及抗氧化活性的研究报道。

本文以黄陵县店头林场采集的辽东栎橡碗为原料,采用Box-Behnken试验设计响应面分析,探索辽东栎橡碗单宁提取的最优工艺,并对所提取的单宁进行了抗氧化活性分析,以期为提高辽东栎综合利用率及经济价值提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

辽东栎橡碗 陕西黄陵县店头林场;单宁酸、钨酸钠、磷钼酸、磷酸、无水碳酸钠、无水乙醇、水杨酸、双氧水、七水合硫酸亚铁、抗坏血酸等试剂 均为分析纯,天津市天力化学试剂有限公司;二苯基苦基肼自由基(分析纯) 日本和光纯药工业株式会社。

R-1001旋转蒸发仪、SHB-Ⅲ循环水式多用真空泵 郑州长城科工贸有限公司;日本岛津UV-1800紫外光分光光度计 宁波新芝生物科技股份有限公司;WLD07S-05型超声波设备 南京三乐超声波技术发展有限公司；FW135粉碎机、HH-6数显恒温水浴锅 图华电器有限公司;TG16-W微量高速离心机 湖南湘仪实验仪器开发有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 单宁的提取 辽东栎橡碗洗净后置于室内阴干,粉碎后过100目筛。将粉碎后的样品保存于4 ℃冰箱内备用。测定时取1 g样品于锥形瓶中,按一定液料比加入一定体积分数的乙醇,置于一定功率、一定温度下提取一定时间,之后,对提取液进行抽滤并收集滤液待测。

1.2.2 单因素实验

1.2.2.1 乙醇体积分数对提取量的影响 取辽东栎橡碗粉末1 g,设置液料比25∶1 mL/g、提取温度40 ℃,在200 W的功率下超声30 min,考察乙醇体积分数分别在20%、30%、40%、50%、60%、70%时单宁提取量。

1.2.2.2 液料比对提取量的影响 取辽东栎橡碗粉末1 g,设置乙醇体积分数50%、提取温度40 ℃,在200 W的功率下超声30 min,考察液料比分别在10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1、60∶1 mL/g时单宁提取量。

1.2.2.3 提取功率对提取量的影响 取辽东栎橡碗粉末1 g,设置液料比25∶1 mL/g、乙醇体积分数50%、在40 ℃下提取30 min,考察超声功率分别在100、150、200、250、300、350、400 W时单宁提取量。

1.2.2.4 提取温度对提取量的影响 取辽东栎橡碗粉末1 g,设置液料比25∶1、乙醇体积分数50%,在200 W的功率下超声30 min,考察提取温度分别在30、40、50、60、70、80 ℃时单宁提取量。

1.2.3 响应面优化试验 根据单因素实验结果,采用Box-Behnken响应面设计法对影响单宁提取的四个因素进行试验设计。试验中各因素编码及水平见表1。

表1 BoX-Behnken试验设计因素及水平Table 1 Factors and coded levels of the Box-Behnken experimental design

1.2.4 单宁提取量的计算

1.2.4.1 标准曲线的绘制 准确称量2 mg单宁酸标准品,定容至100 mL,所得单宁标准溶液质量浓度为20 mg/L。于8个50 mL容量瓶中分别加入0、0.5、1.0、1.5、2.0、3.0、4.0、5.0 mL单宁标准溶液、2 mL F-D显色剂、10 mL 1 mol/L的Na2CO3溶液,60%乙醇定容后,室温下静置30 min,4000 r/min离心10 min后,测定760 nm下单宁溶液的吸光度值。

以单宁浓度c为横坐标,吸光度A为纵坐标,绘制单宁标准曲线图,得到多元回归方程为y=72.988x+0.0015,R2=0.9999。

1.2.4.2 单宁的测定 橡碗单宁的测定采用Folin-Denis法[19]。于50 mL容量瓶中加入待测液1 mL,F-D显色剂2.5 mL,1 mol/L的饱和碳酸钠溶液10 mL,定容。将溶液置于50 ℃水浴锅中,5 min后取出。待冷却后测定溶液在760 nm处的吸光值,以0 mL标准液体系作对照,实验重复3次。依标准曲线及回归方程计算溶液中单宁质量浓度,进而通过下式计算单宁提取量。

式中:C为单宁质量浓度(mg/L);D为稀释倍数;V为待测液体积(L);m为样品质量(g)。

1.2.5 单宁抗氧化活性的测定

1.2.5.1 总抗氧化活性的测定 参照文献[20],配制质量浓度为30、40、50、60、70、80、100 mg/L单宁的样品溶液,于10 mL离心管中加入0.6 mol/L硫酸、28 mmol/L钼酸铵、4 mmol/L磷酸钠各2.0 mL,实验组各离心管中分别加入20、30、40、50、60、70、80 mg/L的单宁样液1 mL,对照组各离心管中加入20、30、40、50、60、70、80 mg/L的VC溶液1 mL。摇匀后将两组离心管置于95 ℃水浴锅中水浴90 min。冷却后于695 nm处测定其吸光度。每次实验重复3次取平均值。

1.2.5.2 1,1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基(DPPH·)清除能力 参照文献[21],测定0.1 mL蒸馏水与3.9 mL DPPH·混合液的吸光值(A0),0.1 mL蒸馏水与3.9 mL 95%乙醇混合液的吸光值(A2)。于3.9 mL DPPH溶液中加入0.1 mL 20、30、40、50、60、70、80 mg/L的单宁样品溶液作为实验组,加入0.1 mL 20、30、40、50、60、70、80 mg/L的VC溶液作为对照。摇匀后室温下静置30 min,于517 nm处测定吸光值(A1)。每次实验重复3次。

DPPH·清除率计算公式为:

1.2.5.3 羟自由基(·OH)清除能力 参照文献[22],于10 mL离心管中加入0.3 mol/L FeSO4,0.25 mL 20 mmol/L H2O2,1 mL 3 mmol/L水杨酸,实验组加入20、30、40、50、60、70、80 mg/L 的样品溶液1 mL,对照组加入20、30、40、50、60、70、80 mg/L的VC溶液1 mL,最后加入蒸馏水使各反应体系体积均为3 mL。2000 r/min离心10 min,于510 nm处测定上清液吸光值。每次实验重复3次。

式中:A0为空白管光吸收值,A1为加入样品后的光吸收值。

1.3 数据处理与分析

本文单因素实验每个水平均重复3次并取平均值。采用Spss 22.0进行单因素方差分析,若因素内差异显著(p<0.05),则进行Duncan多重比较因素间的差异性。采用Design-Expert 8.0进行响应面试验设计及优化。在Excel 2016中绘制单宁酸标准曲线、单因素及抗氧化实验图形。

2 结果与分析

2.1 单因素实验结果

2.1.1 乙醇体积分数对单宁提取量的影响 由图1可知,超声辅助条件下,乙醇体积分数为50%时单宁提取量最高。当体积分数低于50%时,随着体积分数的提高,单宁提取量也显著提高(p<0.05),乙醇体积分数从20%变化为50%时,单宁提取量提高了127.78%。乙醇体积分数由50%提高到60%,单宁提取量显著降低(p<0.05),降幅为26.96%,当乙醇体积分数继续提高(由60%到70%),单宁提取量降幅为4.37%。单宁提取量随乙醇体积分数增大而降低的原因是,乙醇体积分数越大极性越小,进而降低了单宁溶解度[23]。本文选择50%乙醇体积分数进行响应面优化。

图1 乙醇体积分数对单宁提取量的影响Fig.1 Effect of ethanol concentration on the extract yield注:不同字母表示差异显著(p<0.05)。图2～图7同。

2.1.2 液料比对单宁提取量的影响 由图2可知,超声辅助条件下,液料比由10∶1 mL/g提高到30∶1 mL/g,单宁提取量显著提高(p<0.05)。液料比为30∶1 mL/g时提取量已达较高水平。随着液料比继续增加至50∶1 mL/g时,单宁提取量增加不显著(p>0.05)。液料比由30∶1 mL/g增加到60∶1 mL/g,单宁提取量仅提高1.30%。本文选择液料比30∶1 mL/g进行响应面优化。

图2 液料比对单宁提取量的影响Fig.2 Effect of material-liquid ration on the extract yield

单宁的浸提分两个阶段:第一阶段浸提液扩散至样品内部并溶解其中的单宁和其他可溶物,在细胞内形成胞内溶液,与细胞外浸提液形成浓度梯度;第二阶段为在浓度梯度的驱动下,单宁从细胞内转移至浸提液中。此速率与固液两相浓度差(传质推动力)有关。在本实验中,浸提前期,液料比越高,固液两相接触越充分,提取量越高[24-25];随着液料比继续升高,固液浓度差减小,导致传递速率降低,提取量升高不明显。

2.1.3 提取功率对单宁提取量的影响 由图3可知,功率由100 W提高至200 W时,单宁提取量也显著地提高(p<0.05),增幅为56.33%。功率为200 W时,单宁提取量达到最大,为69.13 mg/g。超声功率由200 W提高到300 W,单宁提取量显著降低(p<0.05),降幅为8.10%,其原因类似于温度对提取量的影响,即高功率导致聚合单宁液化失活[23]。随着超声功率继续提高,单宁被充分提取,提取量降低不显著(p>0.05)。本文选择提取功率200 W进行响应面优化。

图3 提取功率对单宁提取量的影响Fig.3 Effect of extraction power on the extract yield

2.1.4 提取温度对单宁提取量的影响 由图4可知,超声辅助条件下,温度由30 ℃提高到50 ℃,单宁提取量显著提高(p<0.05),增幅为72.98%;温度升高至70 ℃时,单宁提取量显著降低(p<0.05),这主要是由于温度过高导致聚合单宁液化而失去活性[23]。本文选择提取温度50 ℃进行响应面优化。

图4 提取温度对单宁提取量的影响Fig.4 Effect of extraction temperature on the extract yield

2.2 响应面优化实验结果

2.2.1 Box-Behnken实验结果 在确定了乙醇体积分数、液料比、提取功率、提取温度这4个单因素的最适范围后,利用Box-Behnken试验设计的方案进行了29次实验得到单宁提取量实测值。实验设计及结果见表2。

表2 Box-Behnken实验方案及结果Table 2 Experimental design and results of Box-Behnken design

2.2.2 响应模型的建立及分析 通过对表2数据进行回归拟合,得到辽东栎橡碗单宁提取量对乙醇体积分数、液料比、提取温度、提取功率的多元回归方程:单宁提取量=70.15-0.14A-0.16B+0.28C-0.14D+0.22AB+1.08AC-0.22AD+0.34BC-0.34BD+0.36CD-1.26A2-0.41B2-0.43C2-0.44D2

2.2.3 响应面图分析 用Design-expert软件对各因素交互作用对单宁提取量的影响做出相应的响应面曲线图,从该图中可以看出各因素交互作用对响应值影响的显著程度并得出最佳工艺参数。3D图曲面倾斜度越大,说明该因素对响应值的影响越大。响应面等高线图是3D图在水平面上的投影,椭圆形表示两因素交互作用显著。圆形表示不显著,响应面等高线图圆心处可以得出最大响应值。

表3 多元回归方程的方差分析Table 3 ANOVA for response surface quadratic model

图5～图10给出了当固定乙醇体积分数、液料比、提取功率、提取温度中任意两个因素为零水平时,其余两个因素的交互作用及对单宁提取量的影响。图5～图10各3D图均较为陡峭,说明各因素交互作用均较明显,与方差分析结果相符。图5～图10各等高线均为椭圆形,说明各因素交互作用对响应值影响均显著,但椭圆的曲率不同,说明各因素交互作用对响应值影响的显著程度不同。图7等高线图为长椭圆形,说明乙醇体积分数与提取功率交互作用对单宁提取量影响最为显著;图6与图8等高线椭圆曲率近似,说明乙醇体积分数与液料比交互作用对单宁提取量影响的显著性近似于乙醇体积分数与提取温度的交互作用;图8～图10等高线图椭圆曲率近似,说明液料比与提取功率、液料比与提取温度、提取功率与提取温度交互作用对单宁提取量影响的显著性近似。

图5 乙醇体积分数与液料比交互作用对单宁提取量的影响Fig.5 Surface and contour plots of mutual-influence of ethanol concentration and material-liquid ration on the tannins yield

图6 乙醇体积分数与提取功率交互作用对单宁提取量的影响Fig.6 Surface and contour plots of mutual-influence of ethanol concentration and extraction power on the tannins yield

图7 乙醇体积分数与提取温度交互作用对单宁提取量的影响Fig.7 Surface and contour plots of mutual-influence of ethanol concentration and extraction temperature on the tannins yield

图8 液料比与提取功率交互作用对单宁提取量的影响Fig.8 Surface and contour plots of mutual-influence of material-liquid ration and extraction power on the tannins yield

图9 液料比与提取温度交互作用对单宁提取量的影响Fig.9 Surface and contour plots of mutual-influence of material-liquid ration and extraction temperature on the tannins yield

图10 提取功率与提取温度交互作用对单宁提取量的影响Fig.10 Surface and contour plots of mutual-influence of extraction power and extraction temperature on the tannins yield

2.2.4 最佳条件的确定和回归模型的验证 为进一步确定最优提取工艺,在设置拟合方程各因素的取值范围后,根据模型使用快速上升法[26-27]进行方案优化,得到的最优方案如下:液料比30∶1 mL/g,乙醇体积分数50%,温度50 ℃,功率200 W,此工艺下单宁提取量为70.152 mg/g。为检验数据的可靠性,取干燥的辽东栎橡碗粉末进行三次验证实验,验证实验单宁平均提取量为70.143 mg/g,相对误差为0.013%。表明经过相应回归方程拟合得出的理论值与实际值吻合,证明用响应面法可以有效优化辽东栎橡碗单宁提取工艺。

曹海霞等[28]通过超声波辅助提取法对蒙古栎橡子单宁脱除工艺进行优化后,发现最优工艺下蒙古栎橡子单宁提取量为69.99 mg/g,本研究同样采用超声波辅助提取法得到最优工艺下辽东栎橡碗单宁提取量为70.143 mg/g,这种差异来源于所选择实验材料,同时,橡碗的采集时间及处理方式也会对单宁提取量造成影响。

2.3 单宁抗氧化活性的测定

2.3.1 总抗氧化活性 以样液浓度(mg/L)为横坐标,吸光值为纵坐标,比较样液浓度为20～80 mg/L时,辽东栎橡碗单宁及抗坏血酸的抗氧化活性差异。

由图11可知,辽东栎橡碗单宁与抗坏血酸的总抗氧化活性均随样液浓度提高而显著提高(p<0.05)。辽东栎橡碗单宁浓度为80 mg/L时,吸光值达到最大,为0.66,较相同质量浓度的抗坏血酸吸光值低25.84%,说明辽东栎橡碗单宁具有一定的抗氧化活性。

图11 不同质量浓度样液的总抗氧化性Fig.11 Total antioxidant activity ofsamples with different concentration

2.3.2 1,1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基(DPPH·)清除率 由图12可知,辽东栎橡碗单宁与抗坏血酸对DPPH·清除率呈显著正相关关系(p<0.05)。辽东栎橡碗单宁浓度为80 mg/L时,DPPH·清除率达到最大,为72.4%,较相同质量浓度的抗坏血酸DPPH·清除率(91.3%)低18.9%,说明辽东栎橡碗单宁具有较强的DPPH·清除率。

图12 不同质量浓度样液的DPPH·清除率Fig. 12 Scavenging rate of samples with different concentration on DPPH·

2.3.3 羟自由基(·OH)清除率 由图13可知,随样液浓度的提高,辽东栎橡碗单宁浓度与·OH清除率呈显著正相关(p<0.05)。辽东栎橡碗单宁浓度为80 mg/L时,其对·OH清除率达到最高值58.7%,较同浓度抗坏血酸(87.3%)低28.6%。表明辽东栎橡碗单宁具有一定的·OH清除能力。

图13 不同质量浓度样液的·OH清除率Fig. 13 Scavenging rate of samples with different concentration on ·OH

3 结论

采用响应面法对辽东栎橡碗单宁提取工艺进行了优化,建立了单宁提取量的回归模型,由该模型优化的单宁提取条件为液料比30∶1 mL/g,乙醇体积分数50%,温度50 ℃,功率200 W,此工艺下理论单宁提取量为70.152 mg/g。为检验数据的可靠性,进行了验证实验,得单宁平均提取量为70.143 mg/g,相对误差为0.013%,说明该模型可靠。辽东栎橡碗单宁具有较强的抗氧化能力,且对DPPH·与·OH均具有较强的清除能力。抗氧化活性及自由基清除能力与单宁质量浓度呈显著正相关。可将辽东栎橡碗作为新型抗氧化剂开发,提高辽东栎资源的综合利用率。