不同产地北沙参多糖的性质和生物活性研究
2018-12-10景永帅张丹参苏蕾张瑞娟吴兰芳郑玉光
景永帅，张丹参，苏蕾，张瑞娟，吴兰芳，郑玉光，*
（1.河北科技大学化学与制药工程学院，河北石家庄050018；2.河北中医学院药学院，河北石家庄050200）
北沙参为伞形科植物珊瑚菜（Glehnia littoralis Fr.schmidt ex Miq.）的干燥根，其性甘，味微苦、微寒，是传统的药食同源物品，具有养阴清肺、益胃生津、调解免疫系统等功效[1-2]，主产于山东、河北、内蒙及辽宁等地[3]。据文献调研，北沙参中含有苷类、多糖类、香豆素类等成分，其中多糖所占比例最大，具有免疫调节、抗氧化等多种生物活性[4-6]。
目前，对北沙参多糖（Glehnia littoralis polysaccharide，GLP）的研究主要集中于同一产地提取方法和含量测定方面[7-8]，对不同产地的理化性质及生物活性的差异性报道较少。本研究以北沙参为原料，采用水提醇沉法对10个产地的北沙参多糖成分进行提取，并对各多糖的理化性质和生物活性进行研究，旨在探清北沙参的产地差异性，并为其质量评价提供理论依据。
1 材料与仪器
1.1 材料与试剂
1，1-二苯基-2-苦味基肼 （1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、α-葡萄糖苷酶、对硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷（p-Nitrophenyl-α-D-galactopyranoside，PNPG）、蓝葡聚糖、标准葡聚糖 T5000、T50000、T150000、T270000：上海阿拉丁生化科技股份有限公司生产；无水乙醇、FeSO4、水杨酸、过氧化氢、混和磷酸盐、无水碳酸钠均为分析纯。
表1 10个产地北沙参样品信息Table 1 10 producing area sample of Glehnia littoralis
1.2 仪器与设备
HH-2恒温水浴锅：江苏金坛宏华仪器厂；N-1100旋转蒸发仪：东京理化株式会社；KS-300DE超声波清洗器：昆山洁力美超声仪器有限公司；UV-2550紫外-可见分光光度计：岛津仪器制造有限公司；TGL-15B高速离心机：上海安亭科学仪器厂；NDJ-4旋转黏度计：上海标卓科学仪器有限公司；S-100傅里叶变换红外光谱仪：珀金埃尔默仪器有限公司；凝胶色谱柱、BSZ-100自动部分收集器、BT-100B数显恒流泵：上海沪西分析仪器厂有限公司。
2 试验方法
2.1 北沙参多糖的提取
分别取10个产地的北沙参，粉碎，过40目筛，用3倍体积的95%乙醇回流提取2次，残渣干燥备用。取200 g北沙参残渣，加入30倍体积的蒸馏水，恒温水浴锅回流 2 h，离心（8 000 r/min、4 min），收集上清液，过滤，减压浓缩至小体积，用4倍体积的无水乙醇醇沉，静置过夜，抽滤，干燥[9]，分别命名为GLP-1、GLP-2、GLP-3、GLP-4、GLP-5、GLP-6、GLP-7、GLP-8、GLP-9、GLP-10。
北沙参多糖提取率的测定：将制备的10组北沙参多糖精密称重，计算其提取率，多糖提取率/%=多糖重量/北沙参干粉重量×100。
2.2 北沙参多糖的理化性质
2.2.1 可溶性总糖含量的测定
采用苯酚-硫酸法，以葡萄糖作为标准品绘制标准曲线，根据标准曲线计算10种北沙参多糖的可溶性总糖含量[10]。
2.2.2 黏度的测定
分别称取1 200 mg10组北沙参多糖样品，在室温25℃条件下，不经超声波和任何辅助条件下溶于300mL蒸馏水中，配置成浓度为4.0 mg/mL的多糖溶液，用黏度计测定其黏度。
2.2.3 紫外-可见光谱分析
分别配制0.1 mg/mL的10组北沙参多糖溶液，用紫外-可见分光光度计在200 nm～800 nm范围内扫描[11]。
2.2.4 红外光谱分析
分别称取1.0 mg的10组北沙参多糖样品，与KBr粉末混匀后压片，傅里叶变换红外光谱仪在4000 cm-1～5 000 cm-1波数范围内扫描[12]。
2.2.5 凝胶渗透色谱法测定分子量分布
2.2.5.1 标准曲线的绘制
分 别 称 取 5.0 mg 标 准 葡 聚 糖 T5000、T50000、T150000、T270000，溶解于5.0 mL的去离子水中，分别上凝胶渗透色谱柱，以蒸馏水为洗脱液，调节凝胶渗透色谱柱流速，设置自动部分收集器收集每管3.0 mL，用苯酚-硫酸法测定样品出峰液分布。计算各标准葡聚糖出峰的洗脱体积Ve，利用已知分子量为200万的蓝葡聚糖确定凝胶柱的空体积Vo，利用无水葡萄糖确定凝胶色谱柱的总体积Vt。以有效分配系数纵坐标，以lgMw（Mw为分子质量，molecular weigh）为横坐标作标准曲线。有效分配系数由以下公式求得：有效分配系数=（Ve-Vo）/（Vt-Vo）。
2.2.5.2 测定多糖分子量及其分布
分别准确称取10组北沙参多糖样品5.0 mg，加入5.0 mL去离子水溶解。将溶解后的多糖溶液放入离心机离心处理，取离心后所得的上清液，过0.45 μm滤膜后上样，以去离子水作为洗脱液，调节凝胶渗透色谱柱的流速，设置自动部分收集器使其每管收集3.0 mL，之后将收集到的每管样品溶液经苯酚-硫酸法显色，测定其吸光度，从而检测出各多糖样品的出峰液体积分布。根据所得的多糖样品的出峰液体积数据，代入所求得的标准曲线方程，从而计算出各组多糖样品的分子量及其分布[12]。
2.3 北沙参多糖的生物活性
2.3.1 抗氧化活性
10组北沙参多糖样品清除DPPH自由基、羟基自由基的测定参照文献方法进行[13-14]。
2.3.2 对α-葡萄糖苷酶抑制活性
10组北沙参多糖样品对α-葡萄糖苷酶抑制活性的测定参照文献方法进行[15]。
3 结果与讨论
3.1 北沙参多糖的提取率、可溶性总糖含量和黏度葡萄糖标准曲线见图1。
图1 葡萄糖标准曲线Fig.1 Glucose standard curve
由图1可知，标准曲线的方程为y=12.967x+0.0858，R2=0.993 7。根据公式计算10组北沙参多糖样品的可溶性总糖含量。10组北沙参多糖样品的提取率、可溶性总糖含量和黏度见表2。
由表2可知，10个不同产地的北沙参多糖提取率在（13.20±0.07）%～（26.75±0.01）%，内蒙锡林郭勒盟产北沙参GLP-8的提取率最高，为（26.75±0.01）%，安徽亳州产北沙参GLP-1的提取率最低，为（13.20±0.07）%。10种北沙参多糖的可溶性糖含量均在80%以上，内蒙赤峰产北沙参GLP-10的可溶性总糖最高，为（89.10±0.10）%，河北保定产北沙参GLP-7的可溶性总糖含量最低，为（81.28±0.02）%。室温25℃，浓度为4 mg/mL的各多糖样品溶液，内蒙赤峰产北沙参多糖 GLP-10 黏度最大，为（9.40±0.10）Pa·s，河北承德产北沙参 GLP-2 黏度最小，为（6.55±0.05）Pa·s。对可溶性总糖含量和黏度进行相关性分析，见表3。
表2 10组北沙参多糖样品的提取率、可溶性总糖含量和黏度Table 2 Extraction rate，sugar content and viscosity of polysaccharides from Glehnia littoralis
表3 可溶性总糖含量与黏度的相关性分析Table 3 Analysis of correlation between soluble total sugar content and viscosity
由表3可知相关性为0.853，属于极强相关，P为0.002，具有强显著性。说明多糖溶液的黏度和可溶性总糖含量成正相关。
3.2 北沙参多糖的理化性质
3.2.1 紫外-可见光谱分析
10组北沙参多糖的紫外-可见光谱图见图2。
由图2可知，在检测范围内，10组北沙参多糖样品均在260 nm～280 nm范围内无明显吸收，说明各产地的北沙参多糖中均不含蛋白质和核酸[16]，在整个研究体系中，可排除蛋白质和核酸的影响。
图2 10组北沙参多糖的紫外-可见光谱图Fig.2 Ultraviolet and visible spectra of 10 groups of Glehnia littoralis polysaccharides
3.2.2 红外光谱分析
10组北沙参多糖的红外光谱图见图3。
图3 10组北沙参多糖的红外光谱图Fig.3 Infrared spectra of 10 groups of Glehnia littoralis polysaccharides
由图3可以看出10组北沙参多糖的峰值，由左向右分别为：3400cm-1为-OH伸缩振动吸收峰，2 927 cm-1处为C-H伸缩振动吸收峰，1 640 cm-1处为-OH吸收峰，1 421 cm-1处为=CH2变形吸收峰，1 161 cm-1处为C-O吸收峰，1 082 cm-1处为醇羟基-OH振动吸收峰，847 cm-1处为α-型糖苷键[17]。10组不同产地的北沙参多糖的吸收峰峰形与位置相似，均具有多糖的特征吸收峰。
3.2.3 分子量分布和大小
标准葡聚糖 T5000、T50000、T150000、T270000经凝胶渗透色谱柱后测得数据，以有效分配系数为纵坐标，以lgMw为横坐标作标准曲线。计算得标准曲线方程为y=-0.409 4x+2.321 2，其R2=0.998 77，表明构建的标准曲线模型较为精确，回归效果和回归拟合效果显著。
将试验所得10组北沙参多糖样品洗脱体积代入求得的标准曲线方程，可求出10组多糖样品中的多糖分子量分布及其大小，如图4所示。
图4 10组北沙参多糖样品分子量分布Fig.4 Molecular weight distribution of 10 groups of Glehnia littoralis polysaccharides
由图4可知多糖经凝胶渗透色谱柱后，有4个特征吸收峰，即10组北沙参多糖样品均由4个不同分子量大小的多糖组分组成，但分子量之间有差别。
3.3 北沙参多糖的生物活性
3.3.1 清除DPPH自由基
10组北沙参多糖对DPPH自由基清除作用见图5。
图5 10组北沙参多糖对DPPH自由基清除作用Fig.5 Scavenging effect on DPPH radical of 10 groups of Glehnia littoralis polysaccharides
由图5可知，10组北沙参多糖样品对DPPH自由基均有一定的清除作用，且呈浓度依赖性。通过比较IC50值，对照品VC和各北沙参多糖对DPPH自由基的清除作用大小：VC（0.005 mg/mL）＞GLP-3（0.237 mg/mL）＞GLP-2（1.324 mg/mL）＞GLP-9（1.749 mg/mL）＞GLP-4（1.854 mg/mL）＞GLP-5 （1.868 mg/mL）＞GLP-7（3.015 mg/mL）＞GLP-6（3.439 mg/mL）＞GLP-10（4.350 mg/mL）＞GLP-1 （5.161 mg/mL）＞GLP-8（5.220 mg/mL）。由此可知，河北安国产GLP-3对DPPH自由基的清除作用最强。
3.3.2 清除羟基自由基
10组北沙参多糖对羟基自由基清除作用见图6。
图6 10组北沙参多糖对羟基自由基清除作用Fig.6 Scavenging effect on hydroxyl radical of 10 groups of Glehnia littoralis polysaccharides
由图6可知，10组北沙参多糖样品均对羟基自由基均有一定的清除作用，且呈现浓度依赖性。对照品VC和各北沙参多糖对羟基自由基的清除作用大小（IC50值）依次为：VC（0.072 mg/mL）＞GLP-3（0.564 mg/mL）＞GLP-6（1.057 mg/mL）＞GLP-4（1.858 mg/mL）＞GLP-5（2.221 mg/mL）＞GLP-1（3.323 mg/mL）＞GLP-8（3.975 mg/mL）＞GLP-10（7.090 mg/mL）＞GLP-9（7.953 mg/mL）＞GLP-7（9.542 mg/mL）＞GLP-2（14.819 mg/mL）。由此可知，河北安国产GLP-3的清除羟基自由基作用最强。
3.3.3 对α-葡萄糖苷酶的抑制活性
10组北沙参多糖对α-葡萄糖苷酶的抑制作用见图7。
图7 10组北沙参多糖对α-葡萄糖苷酶的抑制作用Fig.7 Inhibition on α-glucosidase of 10 groups of Glehnia littoralis polysaccharides
由图7可知，10组北沙参多糖样品均对α-葡萄糖苷酶有一定的抑制作用，随着多糖浓度的升高，对α-葡萄糖苷酶的抑制能力也不断增强，当达到一定浓度时，抑制能力趋于稳定。对比IC50值，对照品阿卡波糖和各北沙参多糖对α-葡萄糖苷酶的抑制能力大小为：阿卡波糖（0.501 mg/mL）＞GLP-3（10.614 mg/mL）＞GLP-8（10.769 mg/mL）＞GLP-5（11.485 mg/mL）＞GLP-4（14.882 mg/mL）＞GLP-6 （18.092 mg/mL）＞GLP-2（20.850 mg/mL）＞GLP-7 （20.993 mg/mL）＞GLP-10（22.873 mg/mL）＞GLP-1 （25.331 mg/mL）＞GLP-9（264.266 mg/mL）。由此可知，河北安国产GLP-3对α-葡萄糖苷酶抑制能力最强。
4 结论
本文通过对10个产地的北沙参的多糖进行提取，对其提取率、理化性质及生物活性进行测定，结果表明，不同产地北沙参多糖的提取率存在差异，内蒙锡林郭勒盟产北沙参多糖GLP-8的提取率最高，为（26.75±0.01）%；可溶性总糖含量范围为（81.28±0.02）%～（89.10±0.10）%，其中产地为内蒙赤峰的北沙参多糖（GLP-10）最高；不同产地北沙参多糖具有相似的紫外、红外光谱学性质及分子量分布；产地为河北安国的北沙参多糖（GLP-3）对DPPH和羟基自由基的清除率以及对α-葡萄糖苷酶的抑制率最高，IC50值分别为0.237、0.564、10.614 mg/mL。不同产地北沙参多糖理化性质及生物活性存在差异，分析原因可能与不同产地北沙参的栽培管理、采收季节、加工方式的不同有关。近年来，由于市场经济刺激，多数种植户以及加工企业有抢收，或者以次充好的情况存在。在推广规范化生产技术的同时，也不能忽视生长环境对北沙参多糖的影响。
