具有动态稀释功能的EA-IRMS联机系统在δ13C和δ15N测定中的应用

孟宪菁，杨 斌，李 安，贾晓艺，朱 湘，马 潇，尹 松

(1.中国科学院西双版纳热带植物园，云南 勐仑 666303；2.赛默飞世尔科技(中国)有限公司，上海 201206；3.北京农业质量标准与检测技术研究中心，北京 100097；4.三门峡市陕州区农业畜牧局，河南 三门峡 472100；5.普洱学院，云南 普洱 665000)

基于快速燃烧的原理，连续流技术的元素分析-稳定同位素比值质谱仪(EA-IRMS)在线联机系统可以将固体或粘稠状样品中有机碳(C)、总氮(N)转化为气态的CO2和N2，实现了碳和氮的稳定同位素组成(δ13C和δ15N)的高精度测量[1-3]。IRMS测定样品气体时，需要引入1个已知同位素值的参考气体作对照[4]。为保证测定结果的可靠性，样品气与参考气的质谱信号强度要尽量接近[5]。由于自然界中样品C、N元素含量和C/N的变化极大，并且不同元素的离子化效率存在较大差异，导致连续流进样的信号强度变化范围极大[1,3,6]。

以往技术人员通过严格控制取样量，基于氦气(He)进行固定比例的稀释，从而使样品气与参考气信号保持一致[5]。但是，该方法耗时、费力，有时甚至需要准确测定待测样品的元素含量。具有动态稀释功能的EA-IRMS联机系统[7-8]可以将测试序列的每个样品的信号强度通过He稀释至参考气信号水平[7]。对于同一测试序列中C/N差异较大的样品，以及难以精确称重的粘稠状样品(如蜂蜜、动物脂肪等)，该系统无需精确控制样品质量，可直接装样上机，大大提高了样品的分析效率[8]。

可以预见，在δ13C和δ15N的测定上，具有动态稀释功能的EA-IRMS有一定的优势和应用前景[8]。然而，目前有关该联机系统在样品测量中的准确性和稳定性考察还未见报道。本工作拟从以下几个方面进行研究：1) 评价具有动态稀释功能的EA-IRMS与以往具有固定比例稀释功能的EA-IRMS测定结果的一致性；2) 探讨具有动态稀释功能的EA-IRMS对不同类型样品δ13C和δ15N测定结果的重复性；3) 评价该联机系统在不同测量时间上的再现性。希望为EA-IRMS技术的应用与发展提供基础数据和科学依据。

1 实验部分

1.1 仪器介绍

EA-IRMS联机系统主要由Flash 2000HT元素分析单元、ConFlo Ⅳ连续流接口装置和DELTA ⅤAdvantage稳定同位素比值质谱仪(美国Thermo Fisher Scientific公司产品)三部分组成。

Flash 2000 HT安装了快速燃烧反应器和高温转化反应器[9]。其中，燃烧反应器将样品在高温和过氧环境下瞬间燃烧，经铜(Cu)还原形成CO2、N2等气体。然后通过除卤、除硫剂(Ag2Co3O4)和干燥剂(Mg(ClO4)2)吸附燃烧产生的卤素、SO2和H2O等气体。纯化的CO2和N2气体经恒温气相色谱柱分离后进入ConFlo Ⅳ，并由氦气进行固定比例的稀释。Flash 2000 HT还配有Smart EA动态稀释组件，控制He流量对进入ConFloⅣ的样品气进行不同比例的稀释[7]，主要参数设定列于表1。

表1 Flash 2000 HT元素分析仪的参数设定Table 1 Parameters of Flash 2000 HT Elemental Analyzer

ConFlo Ⅳ是具有自动稀释功能的连续流通用接口，采用高纯CO2(99.995%)和N2(99.999%)作为参考气，并由高纯He(99.999%)稀释和运载。通过内置的开口分流器将参考气和样品气引入DELTA V Advantage稳定同位素比值质谱仪中，在样品N2出峰之前、样品CO2出峰之后分别引入参考气。

DELTA V Advantage是具有3 kV加速电压的气体稳定同位素比值质谱仪，在1.6×10-4Pa超高真空条件下，该仪器采集CO2气体电离后产生的[12C16O2]+、[13C16O2]+和[12C16O18O]+分子离子束，或N2气体电离后产生的[14N2]+、[14N15N]+和[15N2]+分子离子束，经不同电阻值的放大器转化为电压信号后完成δ13C和δ15N的检测。

1.2 实验方法

为了评价不同稀释方法对δ13C和δ15N测定结果的影响，分别采用不稀释(0)、固定比例稀释(57%)和动态稀释(0～96%)的EA-IRMS联机系统对蜂蜜、猪肉脂肪、猪肉、鸡肉、头发、菠菜、土壤及咖啡因进行测定。这些样品的C和N元素含量分别为0.24%～79%和0.078%～29.5%，其中，土壤样品中C和N含量极低，所以取样量较大。不稀释时，上述8种样品取样量依次为(0.260±0.075)、(0.226±0.093)、(0.181±0.070)、(0.232±0.070)、(0.172±0.026)、(0.274±0.032)、(15.531±1.843)和(0.205±0.052) mg(n=3)；固定比例稀释时，取样量依次为(0.603±0.065)、(0.648±0.016)、(0.647±0.032)、(0.566±0.029)、(0.486±0.063)、(0.559±0.084)、(29.848±2.310)和(0.515±0.083) mg(n=3)；动态稀释时，取样量依次为(0.400±0.191)、(0.504±0.138)、(0.343±0.142)、(0.394±0.184)、(0.480±0.149)、(0.448±0.087)、(42.329±10.209)和(0.377±0.076) mg(n=3)。

为实现动态稀释，需建立EA-IRMS中热导检测器(TCD)与质谱检测器(MSD)信号强度的相关关系。具体方法是：称取不同质量纯尿素，得到TCD与MSD信号强度(ITCD和IMSD)之间的线性关系，即CO2：IMSD=1.4774×ITCD-834.49(r2=0.999 9)和N2：IMSD=1.042 6×ITCD-657.81(r2=0.999 8)；再将后续每个样品的TCD信号代入上述方程得到原始的MSD信号，通过Isodat 3.0软件计算稀释比例[7]，将该MSD信号稀释至参考气信号水平(m/z44：6 V；m/z28：1.5 V)。动态稀释EA-IRMS测定δ13C和δ15N的结果谱图示于图1。

注：1～3为N2参比峰；4为N2样品峰；5为CO2样品峰；6～8为CO2参比峰；9和10分别为TCD检出的N2和CO2样品峰图1 动态稀释EA-IRMS的质谱检测器MSD(a)和热导检测器TCD(b)测定δ13C和δ15N的色谱图Fig.1 Chromatograms of δ13C and δ15N measured by MSD (a) and TCD (b) detectors of EA-IRMS equipped with dynamic dilution component

为探讨具有动态稀释功能的EA-IRMS对不同类型样品δ13C和δ15N测定结果的重复性，在同一个测试序列中对9种不同类型样品(蜂蜜、猪肉脂肪、猪肉、鸡肉、头发、菠菜、苹果、土壤及咖啡因)进行测定。各平行样品之间设置一定的质量梯度，取样量依次为0.278～0.621、0.354～1.318、0.220～1.820、0.237～2.029、0.461～0.638、0.358～3.545、1.739～6.249、16.350～32.687和0.299～0.451 mg(n=3)。

为评价具有动态稀释功能的EA-IRMS在不同测量时间上的再现性，分别于2016年3月4日和4月19日采用该联机系统对上述蜂蜜、猪肉脂肪、猪肉、鸡肉、头发、菠菜和土壤样品的δ13C和δ15N进行分析。2次测定中，样品取样量与上述的δ13C和δ15N测定结果重复性测试接近。

1.3 数据分析

碳和氮的稳定同位素组成采用相对于国际标准物质(VPDB和AirN2)的千分差/‰，用符号δ表示，本文统一简写成δ13C和δ15N。所有被测样品δ13C和δ15N均采取两点线性内插法[4]进行数据标准化，即采用2个不同δ13C和δ15N的标准物质，建立其真值与测量值之间的线性方程，将被测样品的测量值代入该方程后得到标准化的δ13C和δ15N。本研究的2个标准物质分别为USGS40和USGS41，其化学成分均为L-谷氨酸，δ13C真值分别为-26.39‰和37.63‰，δ15N真值分别为-4.52‰和47.57‰。不同稀释方法(不稀释、固定比例稀释和动态稀释)对δ13C和δ15N测量结果的影响，以及具有动态稀释功能的EA-IRMS在不同时间对δ13C和δ15N测量结果的差异性均采用最小显著性差异法(LSD)进行比较。

2 结果与讨论

2.1 不同稀释方法下δ13C和δ15N测定结果的一致性

不稀释(0)、固定比例稀释(57%)和动态稀释(0～96%)下，不同类型样品δ13C和δ15N的测定结果示于图2。动态稀释与固定比例稀释、不稀释相比，δ13C平均偏差分别为(-0.14±0.22)‰和(0.05±0.18)‰。动态稀释与不稀释相比，δ15N平均偏差为(0.02±0.24)‰。3种稀释方法的δ13C和δ15N测定结果不存在显著差异(p>0.05)。大部分样品在不稀释或稀释后的MSD信号强度均大于1 V，受空白效应影响较小；δ13C和δ15N不存在显著非线性问题[10-11]，这可能是不同稀释方法的测定结果较一致的重要原因。δ13C和δ15N的测定结果表明，具有动态稀释功能的EA-IRMS能够满足实验室测试要求[12-13]。尤其当不同样品之间C、N元素含量及C/N差异很大或者难以精确称重时，动态稀释法更加实用且高效[8]。

图2 不稀释、固定比例稀释与动态稀释EA-IRMS测定δ13C(a)和δ15N(b)结果的一致性Fig.2 Consistency ofδ13C (a) and δ15N (b) measurement results by different dilution methods

2.2 动态稀释EA-IRMS对不同样品δ13C和δ15N测定的重复性

具有动态稀释功能的EA-IRMS对不同样品δ13C和δ15N的测定结果列于表2。被测样品的C、N元素含量(0.2%～78.8%和0.077%～29.7%)及C/N(1.68～219)的变化范围均较大，且每种样品的3组平行取样量变化较大，同一样品最大与最小取样量的比例最高接近10倍。动态稀释过程中，通过He将CO2或N2样品气进行了全动态稀释，使CO2或N2样品气与相应参考气的信号强度(m/z44：6 V或m/z28：1.5 V)始终保持一致。结果表明，被测样品δ13C和δ15N变化分别为-27.9‰～-13.9‰和-0.9‰～8.5‰，测定精度分别为0.07‰～0.32‰和0.05‰～0.27‰，满足EA-IRMS测试要求[12-13]。该结果进一步表明，具有动态稀释功能的EA-IRMS能够测定同一测试序列内具有不同质量及C/N的样品。该联机系统可以为提高δ13C和δ15N的分析效率提供强有力的工具[8]。

表2 动态稀释EA-IRMS对不同类型样品δ13C和δ15N的测定结果Table 2 δ13C and δ15N measurement results of different types of samples by EA-IRMS equipped with dynamic dilution component

续表2

注：δ13C和δ15N采用平均值±1SD/‰表示

图3 动态稀释EA-IRMS在不同时间测定δ13C(a)和δ15N(b)结果的一致性Fig.3 Consistency of δ13C (a) and δ15N (b) measurement results by EA-IRMS equipped with dynamic dilution component at different time

2.3 动态稀释EA-IRMS在不同测量时间上的再现性

具有动态稀释功能的EA-IRMS在不同时间的δ13C和δ15N测定结果示于图3。2次测定(间隔45天)中，δ13C和δ15N的测定结果不存在显著差异(p>0.05)，表明该联机系统的测定结果再现性良好。同一样品中，δ13C和δ15N的2次测定结果的平均偏差分别为(-0.05±0.35)‰和(0.16±0.37)‰，能够满足实验室测试要求[12-13]。需要指出的是，土壤δ13C、猪肉脂肪δ13C和菠菜δ15N在不同时间的测定偏差均超过了±0.3‰。这可能由于上述样品在较长的贮存时间内产生了同位素分馏效应[14-16]。另外，样品均匀性较差和测定次数较少也可能导致较大的测定偏差。因此，建议在今后的研究中缩短样品分析周期，均匀研磨与取样，适当增加平行实验，以提高δ13C和δ15N的测定准确性[15,17-19]。

3 结论

本研究采用具有动态稀释功能的EA-IRMS联机系统，快速测定了不同类型的固体和粘稠样品的δ13C和δ15N，并与传统方法进行对比。结果表明，该联机系统对δ13C和δ15N的测定结果与传统固定比例稀释、不稀释法相比具有较好的一致性，3种稀释法测定结果的平均偏差为±0.15‰，能够满足实验室测试要求。通过测定具有不同C、N含量和C/N比值的9种样品，结果表明，该联机系统对δ13C和δ15N的测定结果具有良好的重复性。利用He对样品气进行全动态稀释，可使样品气与参考气的信号强度保持在相等水平，δ13C和δ15N的平均精度均优于0.2‰。此外，该联机系统在不同测量时间(间隔45天)具有较好的再现性，大部分样品δ13C和δ15N的2次测定结果偏差分别小于0.2‰和0.3‰。该研究结果对提高EA-IRMS的δ13C和δ15N测定效率具有借鉴意义。