实时荧光定量PCR仪用于流感病毒检测的效果分析探讨

史志坤 朝阳市疾病预防控制中心 微生物检测所 （辽宁 朝阳 122000）

内容提要： 目的：探讨实时荧光定量PCR仪用于流感病毒检测的效果。方法：选择2016年11月～2017年12月本实验室收治210例流感病样病例的患者作为本次实验的研究对象，运用实时荧光PCR法测定患者的咽拭子标本的流感病毒核酸，检测呈阳性标本执行MDCK培养并给予分离，分析两种方法的检测结果，对比特异性、灵敏度。结果：实时荧光定量PCR仪检测出阳性标本72例，阳性率34.3%；细胞培养法从72例阳性标本中分离40例流感病毒，阳性率为19.0%。对比两种方法检测结果，实时荧光定量PCR仪检测阳性率明显比细胞培养法要高（P＜0.05）。结论：实时荧光定量PCR仪可以迅速且有效检测出流感病毒核酸，成为高效诊断方式。

目前流感病毒呈现变异高度化，耐药性日益增强，新亚型流感病毒不断涌出等特点，防控流感病毒的形势极为严峻[1]。本次实验选择2016年11月～2017年12月本实验室收治的210例流感病样病例的患者作为本次实验的研究对象，实验研究结果如下。

1.资料与方法

1.1 标本采集

选择2016年11月～2017年12月本实验室收治的210例流感病样病例的患者作为本次实验的研究对象，提取所有患者的咽拭子标本，患者体温都在38˚C以上，并有咳嗽、咽痛等症状，标本采集存放在3mL标本管中，24h内送去检测。

1.2 实时荧光PCR检测

所有标本接受病毒核酸检测，遵循试剂盒说明执行RNA提取与反应体系，运用SDS软件操作实时荧光PCR系统，设立阳性与阴性对照，反应程序分为以下：①5个循环：50˚C定为30min、95˚C定为3min、95˚C定为15s、50˚C定为30min、72˚C定为1min；②40个循环：95˚C定为10s、55˚C定为40s。设定荧光素为FAM，当55˚C时，收集荧光信号。

1.3 细胞培养法检测

经实时荧光定量PCR仪检测呈阳性标本，运用细胞培养法对其加以分离、接种，再对其类型加以分类。以25mL/瓶的比例接种每份标本，每份标本2瓶，第2天观察标本有无细胞病变（CPE）。借助豚鼠血执行血凝试验，对血凝素（HA）及其滴度进行严密观察，若HA滴度＜1:8或者阴性培养物盲传第2代之后依旧呈阴性的，就抛弃这些标本。根据国家流感中心提供的标准参照血清，对符合HA滴度试验标准者试验HAI，并对病毒类型进行分类。

1.4 检测敏感性、特异性

经细胞培养法检测呈阳性菌株提取细胞培养液，依据实时荧光定量PCR仪检测程序，再次开展检验与病毒类型的分类。

1.5 统计学分析

此次实验所有数据全部由SPSS21.0版统计软件进行处理，计量资料采用±s表示，采用t检验进行组间数据对比；以%表示计数资料，采用χ2检验比较组间资料。以P＜0.05代表差异有统计学意义。

2.结果

2.1 对比两种检测方法的检测结果

实时荧光PCR法检测出72例阳性标本，138例阴性，阳性率34.3%；病毒分离培养法检测出40例阳性标本，170例阴性，阳性率为19.0%。对比两种方法检测结果，实时荧光定量PCR仪检测阳性率明显比细胞培养法要高（P＜0.05）。

2.2 对比两种方法检测灵敏度、特异性

实时荧光PCR法检测出72例阳性标本，全部由病毒分离培养法检测，其中45例呈阳性反应，运用MDCK细胞分离培养法测定的138例标本呈阴性，而此138例标本是经实时荧光PCR法检测呈阴性的标本。MDCK细胞分离培养法与实时荧光PCR法检测的一致率为87.1%，细胞分离培养法灵敏度是实时荧光PCR法的62.5%，特异性则为100%，两者差异具有统计学意义（P＜0.05），见表1。

表1.对比两种方法检测灵敏度、特异性(n)

3.讨论

流感病毒的实验室诊断流感病毒最常用的方法就是分离病毒、鉴定病毒，经细胞培养法进行分离的流感病毒可以确保流感病毒的抗原性与原始标本保持一致性，以利长时间储存，可以较好分析病毒抗原性和基因[2]。但是MDCK细胞所分离的病毒不可以用来生产疫苗，根据现行实践研究结果判断，细胞培养法的检出率会受到病毒载量、被检样品质量的一定影响，如果被检样品质量较低或病毒载量不够时，就易产生假阴性[3]。此外，细胞培养法仅适用于活体病毒，因此收集标本、保存标本时，需要保证病毒活性。

聚合酶链反应（PCR）可以扩增特定核苷酸片的指数级，结束扩增反应后，运用凝胶电泳方式定性分析扩增物，借助放射核素进行标记后的光密度扫描方式，开展定量分析[4]。实时定量PCR指实时检测PCR扩增反应中每一个循环产物荧光信号，从而定量与定性分析起始模板，随着实时荧光定量PCR反应产物的增多，荧光信号强度也随之增强，当历经一个循环，就有一个荧光强度信号被收集到，如此以来，就可凭借荧光强度的变化，观测产物量变化情况，最终构成荧光扩增曲线图[5]。

实时定量PCR检测法提取病毒RNA时间在2.5～4h左右，针对甲型流感病毒此法有较高特异性，可以识别多株多亚型甲型流感病毒，对比血清学诊断法、特异性抗体检测法，此法有较高灵敏性，但是实时定量PCR检测法需要在条件较高的实验室中实施，实验室要求配备特殊仪器，需要专业操作人员操作，难以全面普及。

实时荧光PCR检测法可以准确、迅速、灵敏检测流感病毒，被国内广泛应用于临床诊断。

本次试验研究结果表明，实时荧光PCR法检测出72例阳性标本，138例阴性，阳性率34.3%；病毒分离培养法检测出40例阳性标本，170例阴性，阳性率为19.0%；对比两种方法检测结果，实时荧光定量PCR仪检测阳性率明显比细胞培养法要高。实时荧光PCR法检测出72例阳性标本，全部由病毒分离培养法检测，其中45例呈阳性反应，运用MDCK细胞分离培养法测定的138例标本呈阴性，而此138例标本是经实时荧光PCR法检测呈阴性的标本。MDCK细胞分离培养法与实时荧光PCR法检测的一致率为87.1%，细胞分离培养法灵敏度是实时荧光PCR法的62.5%，特异性则为100%。

综上所述，实时荧光PCR法可以准确、迅速检测流感病毒核酸，有着高特异性、高灵敏性、便捷的优势，可以成为实验室快速诊断流感病毒的高效方式。