GB/T 16886.5-2017中MTT细胞毒性试验方法解读

胡煜雯 高静贤 江苏省医疗器械检验所 （江苏 南京 210019）

内容提要： 细胞毒性试验是评价医疗器械生物相容性的重要检测项目，其中MTT细胞毒性试验被视为较常规的一种试验。GB/T 16886.5-2017已于2018年7月1日正式实施。目前国内关于医疗器械MTT细胞毒性具体试验方法有三种，分别收入在GB/T 16886.5-2017、GB/T 14233.2-2005和GB/T 16175-2008中。文章对三种MTT试验方法进行比较并对新版的GB/T 16886.5中MTT方法进行解析，以为相关检测人员提供参考。

体外细胞毒性试验是医疗器械生物学评价体系中最常用的检测指标之一，它是一种在离体状态下模拟生物生长环境，检测医疗器械产品接触人体组织后生物学反应的体外试验[1]。MTT试验是医疗器械细胞毒性试验常规的试验方法之一。2018年7月1日，GB/T 16886.5-2017《医疗器械生物学评价 第5部分：体外细胞毒性试验》正式实施。该标准替代了GB/T 16886.5-2003，等同采用ISO 10993-5:2009。下文将对新版GB/T 16886.5中MTT方法进行解析。

1.GB/T 16886.5-2017与GB/T 16886.5-2003的比较

GB/T 16886.5-2017较GB/T 16886.5-2003相比，不是单纯的指南性标准，而是加入了细胞毒性具体试验方法和评价指标[2]。其中增加了MTT试验。其原理是：在活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶和细胞色素C作用下，MTT被还原成不溶于水的蓝紫色结晶甲臜，而死细胞缺失琥珀酸脱氢酶不能将MTT还原，故甲臜的生成量与样本中的活细胞数目成正比[3]。MTT试验通过用光度计测定甲臜溶于醇类后的色度来判断细胞的存活率。MTT法是一项定量的试验方法，能更准确地判断医疗器械产品细胞毒性指标。

2.GB/T 16886.5-2017与GB/T 14233.2-2005中MTT试验方法的区别

目前涉及医疗器械MTT细胞毒性具体试验方法的国标有三份：GB/T 16886.5-2017、GB/T 14233.2-2005和GB/T 16175-2008。3种MTT试验方法有所不同（见表1）[4,5]。

3.GB/T 16886.5-2017中MTT试验要点解析

3.1 浸提介质和培养基的选择

GB/T 16886.5-2017指出首选含血清培养基作为浸提介质，因为不仅可以支持细胞生长，还具有浸提极性和非极性物质的能力。另，GB/T 16886.5-2017的MTT试验中明确了培养基使用最低限量基本培养基（MEM）。MEM是动物细胞培养中常用的一种基础培养基，相比RPMI1640、F-10等更适合贴壁细胞的培养。美国典型培养物保藏中心（ATCC）亦推荐MEM为L929细胞的常规培养基[6]。

表1.GB/T 16886.5-2017、GB/T 14233.2-2005及GB/T 16175-2008中MTT试验的主要区别

3.2 试验方法

GB/T 16886.5-2017的MTT方法中细胞接种密度为1×104/100µL，是GB/T 14233.5-2005中的细胞接种密度的10倍。细胞生长进入对数生长期之前，对生长环境变化较为敏感，所以细胞毒性试验宜选择细胞处于对数生长期阶段进行换液步骤。相关研究表明，接种密度为1×103/100µL时，L929细胞在24h仍处于缓慢增殖状态，会扩大细胞对待检物的反应；而密度为1×104/100µL时，细胞在24h后便进入了对数生长期，细胞状态较为稳定，适合给予待检物浸提液[7]。

GB/T 16886.5-2017的MTT方法指明换液后继续培养24h再进行MTT反应，而未指出可以48h、72h或更长时间培养。原因在于：换液后培养时间越长，空白对照组细胞可能会因进入平台期而受到抑制甚至凋亡，导致空白对照组增值率的降低，从而会出现假阴性结果。

3.3 MTT溶液

为了避免酚红影响MTT溶液的颜色，GB/T 16886.5-2017中在MTT溶液的配制中提出需用“不含酚红的MEM培养基”。此外，在加入MTT溶液之前，也必须将原浸提液移出，是因为浸提液中的成分会还原MTT或与MTT发生其他反应。这些都是为了防止试验中假阴/阳性结果的出现。

3.4 最终结果判定

不同于GB/T 14233.2及GB/T 16175的分级判定，2017版GB/T 16886.5采用了存活率百分比判定。在参考波长650nm时测量在570nm的光度值，存活率为试验样品100%浸提液光密度平均值与空白对照组光密度平均值的比值。若试验样品100%浸提液的存活率小于空白对照组的70%，说明该试验样品具有潜在的细胞毒性。

4.讨论

GB/T 14233和GB/T 16175均以GB/T 16886.1为基础，根据具体适用产品的特性制定而成，与GB/T 16886.5一样具有方法等同性。对于这三种MTT试验方法，需注意这三份标准的适用范围。GB/T 16886.5面对的对象为所有的医疗器械，而GB/T 14233.2仅适用于医用输液、输血、注射器具，GB/T 16175仅适用于医用有机硅材料。当细胞进入对数生长期之前给予刺激物，会扩大细胞对待检物的反应，所以是否GB/T 14233.2和GB/T 16175的MTT法相对GB/T 16886.5的更为严格还需要大量的检验数据统计和研究。

此外，医疗器械产品种类繁多，发展迅速，MTT试验是否适合所有的医疗器械还值得进一步的研究。例如，刘永帅[8]指出在测试葡聚糖磁性纳米材料时，MTT试验过高评价了其细胞毒性，出现了假阴性的结果。新版GB/T 16886.5保留了旧版中的直接接触法和间接接触法，故在评价细胞毒性指标时需了解待检产品的理化性质，深入贯彻GB/T 16886.1再来选择合适的试验方法。

GB/T16886.5-2017较旧版还增加了XTT细胞毒性试验，XTT能被代谢活细胞转化为橙色水溶性的甲臜，可直接测定光度值，避免了MTT还原产物因溶解不全而影响结果的问题；另有研究表明XTT还原产物更为稳定，更适合大批量样品的分析。在细胞毒性常规检测方法中，CCK-8检测法未被收入新版16886.5中。但现已有诸多实验人员发现CCK-8生成的产物不破坏细胞，比MTT法重复性较好、灵敏度更高[9]。MTT、XTT、CCK-8这些细胞毒性试验方法值得利用不同材料的医疗器械进行深入地交叉比对。

综上所述，不同的试验细节均会导致不同的结果，为客观科学地评价医疗器械的细胞毒性，根据所选用的细胞系，细胞毒性试验应严格遵从标准。但当一个评价项目具有多种试验方法时，需要结合实际产品的特性，并考虑试验的原理、灵敏性、重现性等因素来选择试验方法。