酶辅助超声法提取黑种草总皂苷的工艺优化

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(1.新疆大学生命科学与技术学院,新疆乌鲁木齐 830046;2.新疆维吾尔自治区药物研究所,新疆乌鲁木齐 830004)

维吾尔药黑种草子,维吾尔语名“斯亚旦”[1],蒙古名叫“哈日-孜拉”,傣语称“景郎”,为毛茛科(Raunnculaceae)黑种草属(Nigella)植物瘤果黑种草(NigellaglanduliferaFreyn et Sint)的干燥成熟种子,主要栽培种植于新疆南疆地区,收载于各版《中国药典》、《维吾尔药志》等医药文献中。目前,黑种草中已分离出十多种皂苷,具有抗炎[2]、抗氧化[3]、抗恶性肿瘤[4]、降糖[5]、镇咳、镇痛[6]及祛痰[7]等多种活性作用,具有一定的开发价值。

由于黑种草子含有大量的淀粉纤维素等大分子物质,一般的有机溶剂无法使细胞壁破裂,可能会影响皂苷的提取效率。而利用酶的专一性和高效性可使细胞壁破裂、疏松,被淀粉、纤维素等大分子包裹的有效成分释放出来,从而减少传质阻力,提高提取效率[8]。超声辅助提取法是利用超声波的强烈震动、强烈的空化效应、搅拌等作用,将植物细胞破坏之后使溶剂直接进入细胞中,从而促进提取成分在溶剂中的溶解[9]。酶辅助超声提取法结合了酶法和超声提取法优点,不仅提取时间短、得率高,并且能很好地保持提取物的特性和品质[9],广泛应用于中草药活性成分的提取。目前已有加热回流法[10]和超声辅助提取法[11]提取黑种草总皂苷的报道,但得率不高。

本文采用酶辅助超声法提取黑种草总皂苷,以黑种草总皂苷得率为考察指标,通过单因素实验和响应面试验设计优化提取工艺参数,以期为黑种草资源的综合开发、利用提供一定参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

黑种草药材 新疆乌鲁木齐市二道桥药材市场;黑种草皂苷A对照品 纯度≥98%,新疆维吾尔自治区药物研究所值化室制备;无水乙醇 天津市富宇精细化工有限公司;香草醛 天津市北联精细化学品开发有限公司;硫酸 永清县永飞化学试剂有限公司;纤维素酶(≥40 U/mg)、半纤维素酶(≥10 U/mg)、果胶酶(≥30 U/mg)、高温淀粉酶(≈30 U/mg) 如吉生物科技;B-广范试纸 中国·上海三爱思试剂有限公司。

WV-754型紫外分光光度计 上海菁华科技仪器有限公司;AS10200AD型超声清洗机 天津奥特赛恩斯仪器有限公司;XMTD-4000型电热恒温水浴锅 北京市永光明医疗仪器有限公司;Bp211D型电子天平 德国Sartorius有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 黑种草总皂苷标准曲线的绘制 参照文献[10]采用硫酸-香草醛-无水乙醇法绘制黑种草皂苷A标准曲线。以黑种草皂苷A标准溶液的浓度(μg/mg)为横坐标,测定的吸光度为纵坐标绘制标准曲线,得到黑种草皂苷A标准曲线方程为A=0.0096c-0.0473,r=0.9971,检测线性范围为49.78～132.75 μg/mg。

1.2.2 黑种草总皂苷的提取 称取脱脂、粉碎并过40目筛的黑种草1 g,放入锥形瓶中,在一定酶、温度和时间下进行超声处理,中途不断搅拌。用滤纸过滤,取上清液检测,将吸光度代入标准曲线回归方程求出溶液中总皂苷浓度,按下列公式计算黑种草总皂苷得率:

式中:W表示总皂苷得率,%;c表示根据吸光度值计算出的溶液质量浓度,mg/mL;D表示溶液稀释倍数;V表示供试品溶液体积,mL;m表示药材取样量,mg。

1.2.3 酶制剂的选择 称取4份1.0 g脱脂黑种草,分别向其中加入占原料质量1%的纤维素酶、果胶酶、半纤维素酶、高温淀粉酶,将一份未加任何酶制剂的样品作对照组。每份样品分别加50倍量30%乙醇,加入盐酸缓冲液,改变pH,pH分别设定3、4、5、6,将上述各组样品于60 ℃,超声频率12 kHz下超声30 min,酶解后,各组样品经灭酶(沸水浴5 min),过滤得到上清液。分别从各组中取适量提取液,计算黑种草皂苷得率。

1.2.4 单因素实验 采用1.2.2方法提取黑种草总皂苷,固定实验条件为提取液温度为60 ℃、超声波频率为12 kHz、超声处理30 min、乙醇浓度为30%、乙醇溶剂为50 mL、酶添加量为1%。分别考察各单因素酶添加量(0.6%、0.8%、1.0%、1.2%、1.4%)、乙醇浓度(30%、40%、50%、60%、70%),料液比(1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50 g/mL),超声时间(10、20、30、40、50 min)、超声频率(12、24、36、48、60 kHz)、温度(30、40、50、60、70 ℃)对黑种草总皂苷得率的影响。

1.2.5 响应面试验 在单因素试验的基础上选取酶添加量、酶解温度、料液比、乙醇浓度4个因素为考察因素自变量,以黑种草总皂苷得率(Y)为响应值,根据中心组合试验设计(central composite design,CCD)原理[12-14],设计4因素3水平响应面法优化提取工艺,以-1、0、1编码分别代表自变量低、中、高水平,因素水平编码见表1。

表1 响应面试验因素与水平表Table 1 Factors and levels of response surface methodology

1.3 数据处理

采用Design-Expert 8.0.6软件进行方差分析,Origin 8.5软件作图。

2 结果与分析

2.1 酶制剂的筛选结果

如图1所示,不同种酶在不同pH的条件下,所得总皂苷得率也不相同。随着pH的增加,不同种酶的总皂苷得率均增加,当pH等于6时,半纤维素>果胶酶>淀粉酶>纤维素酶>无酶。原液的pH为6.5,从经济性和操作性考虑,不改变pH,选择半纤维素酶进行接下来的试验。

图1 酶制剂对总皂苷得率的影响Fig.1 Effect of enzyme preparationon the total saponin extraction rate注:与无酶相比,**表示差异极显著(p<0.01)。

2.2 单因素实验结果

2.2.1 酶添加量对总皂苷得率的影响 如图2所示,酶添加量为0.6%～1.0%时，随着酶添加量的增加,总皂苷的得率缓慢增加,但当酶添加量超过1.0%后,得率减少,推测酶添加量过多不利于总皂苷的充分溶出,而使总皂苷得率降低。为了进一步考察酶添加量对总皂苷提取效果的影响,分别选择酶添加量占0.8%、1.0%、1.2%进行响应面试验设计。

图2 酶添加量对总皂苷得率的影响Fig.2 Effect of enzyme dosageon the total saponin extraction rate

2.2.2 乙醇浓度对总皂苷得率的影响 如图3所示,随着乙醇浓度的增加(30%～50%),得率不断增加,当乙醇浓度为50%时,总皂苷的得率最大,之后随着乙醇浓度的增大,得率缓慢下降,可能是因为乙醇浓度越高,提取出来的杂质越多,从而限制了总皂苷的溶出,得率逐渐下降。为了进一步考察乙醇浓度对黑种草总皂苷得率的影响,选择乙醇浓度40%、50%、60%进行响应面试验设计。

图3 乙醇浓度对总皂苷得率的影响Fig.3 Effect of ethanol concentration on the total saponin extraction rate

2.2.3 料液比对总皂苷得率的影响 如图4所示,随着料液比的增加(1∶10～1∶30 g/mL),得率也相应增加,当料液比到达1∶30 g/mL时,得率最高,但当料液比超过1∶30 g/mL后,总皂苷得率呈现下降的趋势。溶剂较少时，不能与物料充分接触，使得总皂苷没有充分溶出，随着溶剂量的增加，总皂苷逐渐溶出，溶剂量过高时，溶液中总皂苷达到了饱和，得率不再增加。为了进一步考察料液比对得率的影响,选择料液比分别为1∶20、1∶30、1∶40 g/mL进行响应面试验设计。

图4 料液比对总皂苷得率的影响Fig.4 Effect of solid to liquid ratio on the total saponin extraction rate

2.2.4 酶解超声时间对总皂苷得率的影响 如图5所示,随着超声时间的增加,得率不断的增加,当超声时间为30 min时,得率趋于平缓。超声时间较短时,总皂苷溶出时间较短,溶液中总皂苷含量较低,超声时间达到30 min时,达到总皂苷溶出的最大限度,继续延长超声时间，增加趋势趋于平缓。从经济性考虑,选取酶解超声时间为30 min进行接下来的试验。

图5 酶解超声时间对总皂苷得率的影响Fig.5 Effect of enzymatic hydrolysis time on total saponin extraction rate

2.2.5 超声频率对总皂苷得率的影响 如图6所示,随着超声频率的增加,总皂苷得率整体呈升高趋势,当超声频率为60 kHz时,总皂苷得率为最高。故选择超声频率为60 kHz进行接下来的试验。

图6 超声频率对总皂苷得率的影响Fig.6 Effect of ultrasonic frequency on the total saponin extraction rate

2.2.6 酶解温度对总皂苷得率的影响 如图7所示,随着酶解温度的增加,得率不断增加,当酶解温度为60 ℃时,总皂苷得率最大,当酶解温度超过60 ℃后,总皂苷得率反而减小,这是由于酶解温度过高,导致酶活力下降,甚至造成酶活力失活,释放不出被大分子包裹中的皂苷,导致总皂苷的得率降低。为了进一步考察酶解温度对得率的影响。选择酶解温度分别为50、60、70 ℃进行响应面试验设计。

图7 酶解温度对总皂苷得率的影响Fig.7 Effect of enzymolysis temperatures on the extraction rate of total

2.3 响应面试验

2.3.1 响应面试验设计与结果 根据单因素试验结果,采用Box-Behnken的中心组合试验设计原理[12-14],以总皂苷得率为考察指标,选取酶解温度A、乙醇浓度B、料液比C、酶的添加量D四个因素,进行4因素3水平响应面试验,试验结果见表2。

表2 响应面试验设计及结果Table 2 Design and results of response surface experiment

2.3.2 响应面分析 对表3中数据进行回归拟合,得到自变量与黑种草总皂苷得率(Y)的二次项回归方程为:

Y=-33.65617+0.73313A+0.38525B+0.18115C+26.55417D+(-2.50000E-004)AB+(+1.6750E-003)AC+0.29750AD+(+3.20000E-003)BC+0.04BD-0.21750CD+(-9.31500E-003)A2+(-4.85250E-003)B2+(-3.26500E-003)C2-19.38125D2

由表3可知,模型一次项A、C、D极显著(p<0.01),B显著(p<0.05);二次项A2、B2、C2、D2均处于极显著水平(p<0.01);交互项AD和CD均极显著(p<0.01),BC为显著(p<0.05),AB、AC、BD均不显著(p>0.05)。在各影响因素中,酶解温度(A)对黑种草总皂苷的影响最大,其次是料液比(C)、酶添加量(D)和乙醇浓度(B)。经Design-Expert 8.0.6优化,通过对回归模型求解方程,得出黑种草酶解超声法最佳条件为:酶解温度57.51 ℃,乙醇浓度54.29%,料液比1∶36.54 g/mL,酶添加量0.98%,在此条件下黑种草总皂苷得率的预测值为14.17%。

表3 方差分析Table 3 Analysis of variance

响应面坡度越大，表明因素对响应值影响越大,等高线密集呈椭圆形，表示两因素交互影响大,而坡度平缓、等高线呈圆形则与之相反[15]。响应面坡度越大,中心凸点越突出,说明该因素对黑种草总皂苷得率的影响越大[16]。从图8a、图8c中可以看出,AD、CD的交互作用对黑种草总皂苷的得率有显著影响;由图8b可知,因素B(乙醇浓度)与因素C(料液比)的交互作用对黑种草总皂苷的得率也有显著影响,但其影响程度略弱于AD、CD。

图8 各因素交互作用对黑种草总皂苷得率影响的响应面图Fig.8 Response surface diagrain ofthe interaction of various factors on the extraction rate of total saponins of Nigella glandulifera

2.3.3 验证试验 为检验响应面法优化后的工艺可靠性,考虑实验操作的可行性,以上述最佳条件为参考,选择酶解温度60 ℃,乙醇浓度54%,料液比1∶37 g/mL,酶添加量为0.98%,超声频率为60 kHz,时间为30 min,进行5组重复实验,所得黑种草总皂苷得率均值为14.09%±0.12%,与理论值的相对误差为0.6%,回归方程预测值与实际值相吻合,说明运用响应面法优化得到的模型参数准确可靠,能真实地反映各因素对黑种草总皂苷得率的影响。

3 结论

在单因素实验的基础上,结合响应面法优化酶辅助超声提取黑种草总皂苷的工艺，建立黑种草皂苷得率的二次多项数学模型。该模型极显著(p<0.01),拟合情况较好。最佳工艺条件为:酶解温度60 ℃,乙醇浓度54%,料液比为1∶37 g/mL,酶添加量为0.98%,此条件下黑种草总皂苷得率均值为14.09%±0.12%,总皂苷得率的预测值为14.17%,两者相对误差为0.6%,响应面法优化得到酶辅助超声法提取黑种草总皂苷的最佳工艺,可为黑种草资源的综合开发、利用提供一定参考。