一株乳酸明串珠菌的鉴定及抑菌培养基配方优化

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(锦州医科大学,食品科学与工程学院,辽宁锦州 121001)

内蒙古传统发酵乳制品马奶酒属于传统的自然发酵,其在发酵过程中富含各种乳酸菌,在医疗与保健方面有着明显的作用[1]。其中乳酸明串珠菌(Leuconostoclactis)对多种病原微生物具有抑制作用,因为该菌在代谢过程中会合成细菌素,可以被应用于生物防治或添加剂等方面[2]。

近些年来，许多学者都试图探究马奶酒中乳酸菌及其代谢产物的特性,期望可以在食品保鲜、医疗保健等方面能广泛应用,例如熊骏等[3]从豆豉中筛选到一株具有高效抑菌活性的植物乳杆菌,并对其抑菌机制进行研究,发现其具有新型生物保鲜剂的潜力;雷赵民等[4]研究发现了五株具有抑菌活性的乳酸菌，均能明显改善青贮饲料发酵品质。现阶段,乳酸菌代谢产物产量较低,分离成本较高,为了工业化生产及应用,通过优化乳酸明串珠菌产抑菌物质的培养基配方,能够提高其产量。

本研究以内蒙古马奶酒中的一株抑菌性能方面的优势乳酸菌为研究对象,对其进行16S rRNA基因序列分析,并对该菌株抑制枯草芽孢杆菌抑菌性能的培养基配方进行优化,以便于提高该菌株代谢产生抑菌物质的能力,为该菌株在工业化应用方面提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

乳酸菌株 试验室前期分离保存,GEN BANK注册号为KP408150;枯草芽孢杆菌CMCC(B)63501 由锦州医科大学微生物试验室提供;MRS培养基 酵母粉、牛肉膏、果糖、木糖和吐温80等 杭州滨和微生物试剂有限公司;蛋白Marker、RNA Marker、引物等 宝生物工程有限公司，均为分析纯。

Takara 16S rRNA PCR仪 宝生物工程有限公司;MBMJ-78A高压蒸汽灭菌锅 广州华创医疗器械有限公司;H1850R台式高速冷冻离心机 上海圣科仪器设备有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 乳酸菌株的活化 将已纯化并冻存于甘油中的菌株从-80 ℃冰箱中取出,恢复室温后,吸取100 μL接种于MRS培养基中,37 ℃培养24 h,如此连续活化3代。

1.2.2 菌株16S rRNA基因序列分析 按照细菌基因组DNA提取试剂盒说明书提取菌株DNA,采用16S rRNA基因通用引物进行PCR扩增[5]。对扩增后的产物采用琼脂糖凝胶电泳检测,由宝生物(大连)工程有限公司测序。将测序结果在NCBI数据库中对比分析[6],相似性在98%以上可认为是同一种。利用软件MEGA 5.0构建系统发育树进行分析。

1.2.3 单因素实验

1.2.3.1 不同碳源对抑菌效果的影响 培养基初始pH均为6.5,接种量为2%,温度为37 ℃,培养24 h。以葡萄糖、果糖、木糖、蔗糖、乳糖、麦芽糖分别作为培养基中唯一的碳源[7],对照组不添加碳源,其中碳源添加量为20 g/L,其他培养基成分添加量为普通蛋白胨10 g/L,无水CH3COONa 5 g/L,K2HPO42 g/L,牛肉粉5 g/L,吐温80 1 mL/L,C6H17N3O72 g/L,MnSO40.05 g/L,MgSO40.2 g/L,蒸馏水1 L。采用枯草芽孢杆菌为指示菌,通过牛津杯琼脂扩散法进行抑菌试验,测定抑菌圈,根据抑菌圈直径大小确定出最佳碳源。

1.2.3.2 不同氮源对抑菌效果的影响 在最佳碳源的基础上,氮源分别为大豆蛋白胨、普通蛋白胨、氯化铵、胰蛋白胨、硫酸铵和酪蛋白胨,添加量为10 g/L,对照组则不添加氮源,其它实验条件同1.2.3.1,进一步研究不同氮源对抑菌圈直径大小的影响。

1.2.4 Plackett-Burman试验 根据乳酸菌生长所需营养要素的基本原则,结合以上单因素实验的结果,选取8个影响因素进行试验。利用Minitab软件通过Plackett-Burman试验[8],从而筛选出对乳酸明串珠菌抑菌性影响最为显著的因素。

1.2.5 最陡爬坡实验 根据前期Plackett-Burman实验的结果,确定出各因素的显著性,并明确各显著因素的正负效应,然后设计最陡爬坡实验,根据PB实验结果回归方程系数,确定步长为0.5 (g/L),根据各因素正负效应确定变化方向[9]。

1.2.6 Box-Behnken试验 根据Plackett-Burman试验设计结果,发现蔗糖、蛋白胨、无水乙酸钠对于抑菌圈直径的影响最大,因此以抑菌圈直径作为响应值Y,X1为蔗糖、X2为蛋白胨、X3为无水乙酸钠,进行Box-Behnken试验,最终得到的试验结果用Design Expert进行回归分析[10-11]。为了验证得到的方程模型的准确性,按照最优培养基的配方,对乳酸明串珠菌进行培养,然后通过牛津杯琼脂扩散法进行抑菌试验,重复三次,最终结果取三次的平均值。

表1 Plackett-Burman试验因素及水平Table 1 Factors and levels of Plackett-Burman experiment

表2 Box-Behnken试验因素及水平表Table 2 Factors and levels table of Box-Behnken experiment

2 结果与分析

2.1 菌株鉴定结果

将活化后的菌株接种在MRS培养基上,37 ℃培养24～48 h后,可在培养皿上看到乳白色、表面光滑、有光泽、质地均匀、边缘齐整、活性强的圆形菌落,菌落大小约在0.5～3 mm之间,该菌株革兰染色结果为G+。对该菌株进行16S rRNA序列分析,采用MEGA构建系统发育树,如图1所示,可发现菌株SMN2-1-2与LeuconostoclactisJCM 6123位置最近,16S rRNA基因相似性达到98%,确定该菌株属于乳酸明串珠菌(Leuconostoclactis)。

图1 系统发育树Fig.1 Phylogenetic tree

2.2 培养基配方单因素实验结果

2.2.1 不同的碳源对抑菌效果的影响 由图2可知,添加不同的碳源对乳酸明串珠菌抑菌性的影响不同,原因可能是不同的碳源在利用时,需要产生不同的酶类来催化反应,此外,不同的碳源对发酵产物的合成可能产生不同的作用。从图2中可以看出,当使用蔗糖作为碳源时,抑菌圈直径达到最大,最大可达24.3 mm,且与其他组相比,差异显著(p<0.05),因此,蔗糖被确定为最佳碳源。

图2 不同碳源对抑菌圈直径的影响Fig.2 Effect of different carbon sources on inhibition zone diameter注:相同字母表示差异不显著(p>0.05),不同字母表示差异显著(p<0.05),图3同。

2.2.2 不同的氮源对抑圈效果的影响 以蔗糖为碳源,将氮源分别替换为大豆蛋白胨、普通蛋白胨、氯化铵、胰蛋白胨、硫酸铵和酪蛋白胨,进行抑菌试验,结果如图3所示,当选用的氮源不同时,所测得的抑菌圈直径明显不同,其中当使用蛋白胨作为氮源进行试验时,抑菌圈直径达到最大,最大可达24.8 mm,且与其他组相比,差异显著(p<0.05),其次,效果较好的为硫酸铵与氯化铵,考虑到价格、来源等问题,将氮源确定为蛋白胨。

图3 不同氮源对抑菌圈直径的影响Fig.3 Effect of different nitrogen sources on inhibitory zone diameter

2.2.3 Plackett-Burman试验结果 根据前期的单因素试验结果,采用蔗糖为最佳碳源,蛋白胨为最佳氮源,设计Plackett-Burman试验,分析8个因素对于抑菌圈直径所产生的影响。试验设计与结果见表3。用Y来表示抑菌圈直径,则回归方程为Y=10.01+0.3716A+0.2832B+1.566C+0.247D-0.579E-0.573F+4.93G-5.30H,R2=0.9863,说明回归方程的拟合程度较好。根据试验结果及回归分析表4可得出,因素为A(蔗糖)对抑菌圈直径影响极显著(p<0.01),因素B(蛋白胨)、E(无水乙酸钠)对抑菌圈直径影响显著(p<0.05),其可信度在95%的置信区间内,其它因素影响不显著。根据回归方程系数的正负发现因素E(无水乙酸钠)、F(柠檬酸三铵)、H(硫酸锰)对抑菌圈直径的影响为负效应,其它因素为正效应。因此,后续实验因素E、F、H采用表1低水平中的值,即无水CH3COONa 4 g/L,柠檬酸三铵2 g/L,MgSO40.2 g/L,其它因素采用表1高水平中的值,即蔗糖24 g/L,蛋白胨12 g/L,K2HPO42 g/L,牛肉粉5 g/L,吐温80 1 ml/L,C6H17N3O72 g/L,MnSO40.05 g/L,MgSO40.2 g/L。本实验最终选择A、B、E三个因素,进行爬坡实验,筛选出显著性因素的最佳浓度梯度。

表3 Plackett-Burman试验结果Table 3 The results of Plackett-Burman experimental design

表4 Plackett-Burman试验回归分析Table 4 Regression analysis table of Plackett-Burman design

2.2.4 最陡爬坡实验 以A、B、E三个因素作为影响因素,设计进行最陡爬坡实验,实验设计及结果如表5,根据上述Plackett-Burman实验中回归方程系数确定步长,当蛋白胨的添加量为12 g/L、蔗糖添加量为24 g/L、乙酸钠的添加量为4 g/L时,此时的抑菌圈直径最大,以此条件为Box-Behnken实验设计的中心点,然后进行响应面分析。

表5 最陡爬坡实验结果Table 5 Experimental results of the steepest ascent path

表7 回归模型方差分析Table 7 Variance analysis for regression equation

表6 Box-behnken试验设计及结果Table 6 Design and results of Box-Behnken experiment

图4是由上述回归方程所得到的三维空间响应面图,分别反应了蔗糖、蛋白胨、无水乙酸钠这三种因素两两交互作用对抑菌圈直径的影响。响应面图的坡度越陡,说明交互作用对抑菌圈直径的影响越显著。回归方程中二次项系数为负值时,说明抛物线开口是向下的,也就是说该方程有极大值点。利用Design Expert进行分析计算后,可得最佳培养基配方为:蔗糖添加量为24.83 g/L,蛋白胨添加量为12.72 g/L,无水乙酸钠的添加量为3.95 g/L,按此条件进行试验时,预测得到的抑菌圈最大直径为23.60 mm。

图4 交互作用的响应面图Fig.4 Response surface diagram of interaction

为了充分验证利用响应法所得预测值的可靠性,采用优化后的配方,进行验证性的抑菌试验,重复三次,对得到的抑菌圈直径求平均值,其平均值为(23.40±1.28) mm,与优化前的抑菌圈直径11.2 mm相比,提高了2.1倍,与预测值基本一致，说明该试验方案具有一定的实践价值。

3 结论

本试验首先对从马奶酒中筛选出的一株具有抑菌性能的菌株进行了鉴定,确定菌株为乳酸明串珠菌(Leuconostoclactis)。最终确定的优化培养基配方为:蔗糖为24.84 g/L,蛋白胨12.72 g/L,无水CH3COONa 3.95 g/L,K2HPO42 g/L,吐温80为1 ml/L,牛肉粉5 g/L,C6H17N3O72 g/L,MgSO40.2 g/L,MnSO40.05 g/L,蒸馏水1 L,经过培养基优化后,抑菌圈直径达到了(23.40±1.28) mm,比初始抑菌圈直径大小提高了2.1倍。进行了验证试验后,证明了模型是可靠的、合理的,为该菌株的进一步研究以及将来在工业化方面的应用提供了切实可信的理论依据。