水稻抗病虫基因挖掘及聚合育种研究进展

邹 拓，耿雷跃，张 薇，张启星

（河北省农林科学院滨海农业研究所，河北 曹妃甸 063299）

水稻（Oryza sativa L.）是世界重要的粮食作物之一，全世界有50%以上的人口以稻米为主食，水稻的稳产、高产对保障世界粮食安全具有重要意义。但是，水稻产量受多种因素的影响，其中，生物因素是影响水稻高产稳产的主要因素之一[1]。

作物病虫害是威胁粮食安全的主要因素之一。我国每年由于病虫害造成的产量损失巨大。受品种种植单一、气候、病原物变异以及外来生物入侵等因素的影响，新的病虫害不断出现，传统病虫害的发生规律发生改变，使得病虫害防治工作遇到了更大的挑战[2]。

病虫害对水稻高产稳产影响较大，随着世界人口的日益增加，人类对水稻产量的需求也越来越多[3]。国外研究者认为，水稻的生产潜力可以达到10 t/hm2，但是由于病虫害的影响，农民实际收获的产量大约为5 t/hm2[4]。因此，提高品种的抗病虫害能力是水稻增产的重要措施。目前，生产上应用的大部分水稻品种（组合）抗病虫能力较差，易遭受病虫为害，导致产量和品质不稳定。而过去几十年一直沿用的化学防治方法，因为存在高成本、高毒性、高残留和造成环境污染等问题，也越来越受到人们的摒弃。为了解决使用化学农药引起的环境污染和食品安全问题，迫切需要从遗传上对水稻品种的抗性进行改良[5]。长期实践证明，利用抗性品种来防治病虫害更加经济、高效和环保。

分子生物学的发展促使植物育种进入了生物技术与常规技术相结合的阶段。目前，以分子标记技术为代表的分子育种技术已经成为育种发展的重要方向。采用单基因防治病害存在较大的风险，容易引起单基因抗性丧失而造成较大的病害发生，而且不同的抗病基因之间还存在一定的协同作用，因此，聚合多个不同类型的抗病基因是解决目前水稻病害最切实有效的方法[6]。

分子标记辅助选择（MAS，marker-assisted selection）是随着现代分子生物学技术迅速发展而产生的新技术，其应用主要集中在基因聚合、基因渗入、根据育种计划构建基因系等方面[7]。利用MAS方法来囊括个体抗性遗传组成，可以使不同来源的多种抗性基因聚合在1个栽培变种中。增加新的抗性基因来源对于提高水稻的抗病虫能力及其持久性具有很大帮助[8]。因此，MAS是进行抗性基因聚合的最有效手段。近年来，育种学家利用MAS技术与常规育种技术相结合的方法在聚合水稻抗性基因方面取得了较大的育种成效，培育出一批水稻新品系，其中一些品种（组合）已经通过了审定；同时，在稻米品质改良、高产利用等方面的研究也取得了一定进展[9]。

稻瘟病、白叶枯病和褐飞虱是影响水稻产量与质量的主要病虫害。目前，水稻抗病虫性研究取得了巨大进展，已鉴定、定位和克隆了很多的抗病虫基因，并在实践中得到了广泛应用。

1 水稻稻瘟病研究进展

1.1 稻瘟病概述

稻瘟病是世界水稻的主要病害，由真菌病原体（Magnaporthe oryzae） 引起。1919年在印度首次发现，当年造成水稻减产4%左右[10]。在随后的稻瘟病发生过程中，仅仅在印度东部地区就造成水稻减产50%左右[4，11]。稻瘟病菌具有多样性，在日本造成了水稻不同程度的减产（20%～100%）[12]。国外研究表明，全球每年由于稻瘟病造成的水稻减产量可以满足6 000万人口的粮食需求[13]，导致的直接经济损失高达50亿美元[14]。

稻瘟病在水稻秧苗期至抽穗期均可发生。苗期或分蘖期发病严重时，可导致植株死亡；穗期发病会导致白穗或半饱和穗，产量大幅度降低，严重时可造成水稻绝收。稻瘟病病原菌的生理小种多样，并且变异复杂。目前，对稻瘟病病原菌菌体的研究还停留在初步阶段。病原菌在不同环境条件下具有变异性，应用单一的抗性水稻品种难以解决水稻持久抗稻瘟病的问题，很多抗性品种种植几年后就丧失了抗性[15]，因此，培育具有持久抗性的水稻品种是育种家们主要的育种方向。实践证明，培育具有持久抗性的水稻品种是防治稻瘟病最经济、有效的方法。所以，利用MAS技术将不同的抗性基因聚合，能够在很大程度上提高品种抗性的持久度[16]。

1.2 水稻抗稻瘟病基因的定位与克隆

近年来，随着分子生物学的发展，分子定位成为鉴定水稻抗性基因最方便、直接的方法，且随着水稻基因组测序的完成，越来越多的稻瘟病抗性基因被定位。1992年Mackill[17]首先发现并命名了2个抗稻瘟病基因Pi-1和Pi-2（t），将其分别定位在第11号和第6号染色体；1994年Inukai等[18]得到了同样结果。1999年Wang等[19]克隆了第1个稻瘟病抗性基因Pi-b，位于第2染色体长臂末端。截止到目前，已经被鉴定和定位的抗稻瘟病基因达到了100个以上[20～96]（表1），且大部分抗稻瘟病基因分布在除第3号染色体外的其余11条染色体上，并在第6、11和12号染色体上有大的基因簇分布[97]（图1），其中，约14%被定位于第6号染色体，约24%被定位于第11号染色体，约15%被定位于第12号染色体[98]。在定位的主效基因中，有26个基因 （Pi-a、Pi-b、Pi5、Pi-k、Pik-l、Pikh、Pik-m、Pik-p、Pi-sh、Pi-t、Pit-a、Pi-2、Pi-9、Pizt、Pigm、Pi-d2、Pi-d3、Pi-1、Pi-21、Pi-25、Pi-36、Pi-37、Pb-1、Pi50、Pi54和Pi54rh）已被成功克隆。

表1 已鉴定的抗水稻稻瘟病基因及其位点Table 1 Identified rice blast resistance genes and the loci

续表1

续表1

2 水稻白叶枯病研究进展

2.1 白叶枯病概述

水稻白叶枯病是由革兰氏阴性菌黄单孢水稻变种（Xanthomonas oryzae pv.Oryzae Xoo） 引起的一种细菌性维管束病害，其通过叶尖和叶缘处的排水孔或伤口等进入叶片的被覆组织，随后在其中积累并转移至木质部的导管中。该病可以在水稻的各个时期侵染，造成水稻不同程度的发病，在幼苗或分蘖期发病会造成水稻枯萎甚至死亡，一般水稻在分蘖后期发病严重，尤以抽穗期前后发病最快[99]。

白叶枯病首次在日本发现以来，在世界各地水稻种植区陆续发现，是仅次于稻瘟病的主要病害，严重影响水稻产量，发生严重时可造成水稻绝收[100]。在我国水稻种植区，白叶枯病主要影响长江流域及其以南的水稻产区，而对北方稻区影响较小。该病在潮湿和低洼地区较易发生，一般籼稻重于粳稻，双季晚稻重于双季早稻，单季中稻重于单季晚稻，粘稻重于糯稻[101]。

图1 水稻抗稻瘟病基因在染色体上的分布Fig.1 Distribution of rice blast resistance genes on chromosomes

20世纪60年代末，国际水稻研究所利用当时流行的各种白叶枯病原菌系对广泛收集的各国水稻品种进行鉴定，共鉴定出6个白叶枯病原菌生理小种和100多个抗源。这些抗源在杂交育种中广泛使用，使得水稻抗病育种工作取得了突破性成就[102]。

多年研究表明，水稻白叶枯病是一种寄主性较强的病害。水稻对白叶枯病抗性遗传所表现的寄主与病原菌之间的互作符合典型的基因对基因的关系，也就是说，水稻白叶枯病菌的毒性是不同的，菌系在不同品种上致病力的差异表现为小种特异性的差异，品种携有的主效抗病基因与所控制的病原菌系是相匹配的[100]。

20世纪90年代以前，我国植物病理学研究人员利用当地的鉴别品种将本区域的Xoo分为不同的致病菌群，但由于这些研究采用的鉴别品种、接种方法和调查标准等各不相同，因此，彼此之间无法比较，难以全面了解全国水稻白叶枯菌系的分化。自60年代起，菲律宾国际水稻所和我国相继对水稻白叶枯病的小种分化进行了研究[103]。根据水稻白叶枯病在水稻品种上特异性互作的标准不同，我国将水稻白叶枯病菌株划分为7种致病型[104]（表2）。

表2 我国水稻白叶枯病菌的致病型Table 2 Pathogenic type of rice bacterial blight in China

2.2 水稻抗白叶枯病基因的鉴定、定位与克隆

多年以来，许多专家学者在白叶枯病基因的挖掘和鉴定等方面进行了大量研究，也取得了实质性进展。日本是最早利用寄主抗性防治水稻白叶枯病的国家（从1923年开始进行抗病育种），同时也是最早鉴定出抗白叶枯病基因的国家。截至目前，有多个抗白叶枯病基因已被鉴定和定位，国内外科研人员已鉴定了41个抗水稻白叶枯病基因[105～147]（表3）。其中，29个基因为显性基因，其他基因均为隐形基因，分别位于除第9和第10号染色体外的其他10条染色体上[148]（图 2），有 8 个基因 （Xa1、Xa3/Xa26、Xa5、Xa10、Xa13、Xa21、Xa23和Xa27） 已被克隆 （表4）。

表3 已鉴定的水稻抗白叶枯基因及其位点Table 3 Identified rice bacterial blight resistance genes and the loci

3 水稻褐飞虱研究进展

3.1 褐飞虱概述

褐飞虱（Nilaparvata lugens Stål）属迁飞型水稻害虫，其生命周期分为卵、若虫和成虫3个阶段。卵主要产在稻株下部叶鞘内，在老的稻株上产在叶片中脉两侧组织内。若虫分5龄，体长卵圆形，其中，初龄若虫体长约1 mm，5龄若虫体长约3 mm[149]。成虫的翅型有短翅型和长翅型2种，其中，短翅型褐飞虱属定居型，繁殖能力强，发育进度快；长翅型属迁飞类型，在羽化后不久就具飞翔能力，长翅型群体在一定条件下能随气流上升并借助风力做远距离迁徙。因此，褐飞虱种群分布很广，区域包括东亚、东南亚、南亚次大陆、澳大利亚北部及南太平洋群岛[150]。长、短翅型的分化受基因控制，但环境因子如光照、温度、湿度、稻株营养、稻株生育期和虫口密度等均能影响翅型的分化[151]。即使在相同的遗传基础条件下，褐飞虱的翅型仍可因外界条件的不同而发生变化，即：在不同的环境条件下，基因在表达方面存在着很大差异，翅型分化是由1个受多种因子影响的调控体系决定，且调控作用与性别有关[152]。

图2 水稻抗白叶枯病基因在染色体上的分布Fig.2 Distribution of rice bacterial blight resistance genes on chromosomes

表4 已克隆的水稻抗白叶枯病基因及其功能与表达Table 4 Cloned rice bacterial blight resistance genes and the function and expression

在种植水稻的亚洲国家，褐飞虱是破坏性很强的害虫之一。褐飞虱直接吸食植物的液汁，严重时会导致“叶蝉烧”，造成植物整体变色和脱水，甚至死亡[153]。褐飞虱不仅直接取食造成水稻减产，而且还是壮矮缩病和曲矮缩病病毒的携带者，因此，对水稻的为害更加严重[154，155]。20世纪60年代之后，随着耕作技术的改变以及高产杂交水稻品种的大面积推广应用，褐飞虱由原本仅在中国南方稻区偶有发生逐渐向北扩展并频繁为害，且为害程度呈逐渐加重趋势，每年受褐飞虱为害的水稻种植面积高达400万hm2以上[156]。仅2005年和2008年，褐飞虱直接为害造成的我国稻谷损失量就高达27亿kg；同期在越南，褐飞虱传播的草状丛矮缩病和齿叶矮缩病间接造成稻谷损失 0.4亿 kg[157]。

在过去的50 a，提高宿主抗性一直被认为是一种减少因褐飞虱而造成产量损失的有效方法，国际水稻研究所和其他国家的很多研究者已经把水稻抗褐飞虱研究作为1个主要的研究方向[158]。早在20世纪70年代，国际水稻研究所已经开始选育抗褐飞虱的水稻品种[159]。

20世纪70～80年代，由于褐飞虱在亚洲暴发，使得培育水稻抗褐飞虱品种的研究达到了顶峰阶段；期间，国际水稻研究所育成了一系列含有单个抗褐飞虱主效基因的抗虫品种，并有效地抑制了褐飞虱的为害。到了20世纪90年代，水稻抗褐飞虱的研究和育种工作逐渐减少[160]。然而，从20世纪90年代中期开始，科技工作者在水稻遗传和分子方面的持续研究使得大量的水稻抗褐飞虱基因和数量性状位点（QTL）被发掘，加上近几年褐飞虱在亚洲为害加重，水稻抗褐飞虱的研究又一次成为了热点，研究人员希望通过遗传和分子方面的信息育成新的并具有持久抗性的水稻新品种[161]。在亚洲已经育成了很多具有抗性的品种并进行了推广，但是，随着时间的推移，一些含有抗性基因的品种抗虫性会发生退化，从而产生适应该类抗性基因的褐飞虱生物型，最终将会导致当地褐飞虱种群再次发生暴发增长。因此，如何提高水稻抗虫的持久性，逐渐成为了科技工作者主要的研究方向。实践证明，培育多基因聚合的抗褐飞虱品种能够显著增强水稻的广谱抗性，且能够增加水稻抗虫的持久性。

3.2 水稻褐飞虱的生物型

生物型指同种害虫的不同群体生活在特定的寄主上表现出不同的生存和发育能力或对寄主取食和产卵有不同的嗜好性，曾被许多研究者用来表述致害性不同的类型。目前，已命名了20多种褐飞虱小种。一般将其划分为4种生物型：生物型I、生物型II、生物型III和生物型IV。其中，生物型I和生物型II主要分布于东亚和东南亚稻作区，是最常见的褐飞虱生物型；生物型III是国际水稻研究所产生的实验种群；生物型IV被认为是致害性最强的种群，分布于南亚次大陆[162]。这4种生物型是学者们研究的重点。其他命名的生物型还有李氏禾生物型[163]、澳大利亚型、Mindanao型、Parwanipur型和“九龙江型”等[164]。研究表明，中国各稻区的褐飞虱种群是以生物型II为主的混合群体，在田间自然种群中生物型II占60.1%、生物型I占12.9%[165]。褐飞虱生物型的多样性及其变异机制的复杂性，使得褐飞虱抗性育种工作难度加大。因此，亟须对褐飞虱生物型进行更加深入的研究[166]。

3.3 水稻抗褐飞虱基因的鉴定与克隆

自20世纪70年代起，各国相继展开了水稻褐飞虱抗性基因的发掘工作，第1个抗褐飞虱位点于1970年被鉴定。在最近几年抗褐飞虱基因逐渐被发掘出来，目前国内外文献记载已鉴定的抗褐飞虱主效基因共35个[167～201]（表5），其中29个基因被定位于水稻7条染色体的不同区域，且主要位于第4号和第12号染色体[202]（图3），均占总数的33.3%。

近年来，国内外研究人员在水稻抗褐飞虱基因的克隆研究方面取得长足进展[203]。目前，已经被克隆的褐飞虱抗性基因有位于水稻第3号染色体长臂端的Bph14，位于水稻第4号染色上着丝粒附近的Bph3，位于第12号染色体长臂端的Bph18和Bph26以及位于第6号染色体上的Bphi008a和Bph29。其中，Du等[186]运用图位克隆法从药用野生稻渗入系B5中成功克隆了Bph14，该基因编码包含1个螺旋卷曲-核苷酸结合-富含亮氨酸重复（CC-NB-LRR） 的基序蛋白，主要在维管组织的薄壁细胞中组成型表达，携带该基因的转基因水稻植株在受到褐飞虱的取食后植株韧皮部细胞胼胝质沉积以及产生胰蛋白酶抑制剂抑制了褐飞虱的取食而使植株产生抗性。Liu等[171]利用水稻品种Rathu Heenati（RH） 将Bph3定位在第4号染色体短臂端并克隆，发现Bph3是由3个编码凝集素类受体蛋白激酶（OsLecRK1-OsLecRK3） 的基因组成的基因簇，编码的凝集素类受体蛋白激酶是介导水稻具有广谱持久抗虫效果的主要原因。Jena等[204]利用图位克隆技术成功克隆了位于第12号染色体长臂端的Bph18，该基因编码1个螺旋卷曲-核苷酸结合位点（CC-NBS） 蛋白，其富亮氨酸重复结构域（LRR） 缺失。Tamura等[197]成功克隆了位于第12号染色体上的基因Bph26，其编码1个R（CC-NB-LRR） 蛋白，该基因能够抑制褐飞虱在水稻韧皮部筛管部位取食。Hu等[201]利用抑制差减杂交方法得到1个受褐飞虱取食诱导的单拷贝基因Bphi008a，其表达亦可以被机械伤害以及外源乙烯利所诱导，该基因是1个乙烯信号途径下游的效应基因，在植物体内被磷酸化后通过与OsbZIP60以及SDRP互作组成1个转录复合体来调控一系列OsMAPKS的表达，并最终提高水稻对褐飞虱的抗性。Wang等[200]将Bph29克隆，该基因被定位在第6号染色体短臂上24 kb的区域，Bph29编码的蛋白包含1个高度保守的B3DNA结合域，Bph29在维管束组织中表达，可抑制褐飞虱取食。以上基因的成功克隆使它们介导的抗性机理得以阐明，为抗性育种工作奠定了重要基础。但是，水稻对褐飞虱的抗性机制复杂。因此，只有对抗性基因进行更进一步的研究，才能对其抗性机制有更深入的认识。

表5 已鉴定的水稻抗褐飞虱基因及其位点Table 5 Identified rice brown planthopper resistance gene and the loci

图3 水稻抗褐飞虱基因在第4号和第12号染色体上的分布Fig.3 Distribution of rice brown planthopper resistance genes on chromosome 4 and 12

通过分析已克隆的基因，CC-NB-LRR结构域属于R蛋白。R蛋白由R基因编码而来，根据其结构域的不同，研究人员将其分成5类[205]。其中，NB-LRR结构域是R蛋白中最多的一类；CC-NB-LRR结构域是其中的一种；B3结构域是在高等植物中广泛存在的一种结构域，该结构域能编码110个氨基酸组成的蛋白，是一种能与DNA接合的高度保守结构域，该结构域在植物的逆境胁迫相应和生长发育过程中起着极其重要的作用[206]，该结构域是R蛋白中新发现的一种结构域，对植物抗病虫的研究有着十分重要的意义。

4 水稻抗病虫基因聚合研究的应用

当前，许多的抗病虫基因已经被定位，而且也有一部分被广泛利用，抗病虫的水稻品种培育也取得了一定的进展。但是，目前培育的品种大多为单基因抗性品种，专一性较强，而专一性品种难以满足生产上对病虫害的抗性需要[207]。为了防范单基因抗病虫害品种大面积种植后出现抗性丧失的问题，有必要进一步拓宽抗病虫基因的材料来源，克隆出抗性谱不同的抗病虫基因[208]，并明确这些基因在不同籼、粳稻品种遗传背景下的抗病虫效应。按照设计育种的原理与要求，通过MAS进行基因聚合，不同抗病虫基因间相互组合与作用将会为新育成的水稻品种提供更加稳定和持久的抗性[203]。

育种家利用MAS技术在聚合水稻抗性基因方面取得了较大的育种成效，选育出一批水稻新品系，其中一些品种（组合）已通过审定；而且，在稻米品质改良、高产的利用等方面也取得了一定的研究进展[9]。

Liu等[209]利用MAS技术将2个抗褐飞虱基因Bph3和Bph27（t）导入到易感品种Ningjing3中，得到的聚合系在很大程度上提高了对褐飞虱的抗性，避免了由于褐飞虱影响而造成的产量损失；李进波等[210]利用MAS技术，结合杂交和回交手段，将抗褐飞虱基因Bph14与Bph15进行聚合，获得了抗褐飞虱的双基因聚合株系；李进波等[211]以GD-7为稻瘟病抗性基因供体、扬稻6号为受体，通过回交转育结合MAS，选育出10个双基因（Pi1和Pi2）纯合且农艺性状优良的水稻新品系，并在湖北省水稻品种区域试验的稻瘟病抗性鉴定点恩施和宜昌分别进行了稻瘟病抗性田间鉴定，结果显示，这些品系的抗性综合指数在0.8～2.0，抗级为1级，稻瘟病抗性与较易感病的受体亲本相比显著提高；Hu等[212]利用MAS技术也将水稻抗褐飞虱基因Bph14和Bph15同时聚合到汕优63的亲本珍汕97B和明恢63中，以此来增强汕优63对褐飞虱的抗性；Hu等[213]利用MAS技术将3个抗褐飞虱基因Bph14、Bph15和Bph18聚合到易感品种9311中，结果显示，几个基因聚合后对褐飞虱的抗性有累加效应（Bph14/Bph15/Bph18≥Bph14/Bph15＞Bph15/Bph18≥Bph15＞Bph14/Bph18≥Bph14≥Bph18＞无），对比后发现聚合了3个基因的水稻对褐飞虱具有更强的抵抗力且稻谷产量也得到了提高；Xiao等[214]为了改良恢复系华占的抗病能力，将抗白叶枯病基因Xa23以及抗褐飞虱基因Bph14和Bph15通过分子标记辅助回交策略导入到恢复系中，提高了恢复系的抗性，且改良后水稻产量也有一定的增加；刘开雨等[215]通过利用MAS技术，并结合回交以及抗虫鉴定的方法，将抗褐飞虱的基因Bph3和Bph24（t）分别导入主栽杂交水稻恢复系中，通过表型鉴定最终获得抗性最强的聚合系，表明通过对抗性基因的聚合能够增加品种对褐飞虱的抗性；Usatov等[216]利用MAS技术成功地将3个抗稻瘟病基因Pi1、Pi2和Pi33聚合到俄罗斯的水稻品种中，提高了俄罗斯水稻品种的持久抗性；楼钰等[217]结合分子标记辅助轮回选择和田间鉴定的方法，将抗稻瘟病基因Pi-GD-1（t）和Pi-GD-2（t）、抗白叶枯病基因Xa23和抗褐飞虱基因Bph18（t）导入3个中籼恢复系，获得了8个兼抗稻瘟病和褐飞虱的聚合系，这些聚合系及其与不育系五丰A的测交种对稻瘟病和褐飞虱的抗性水平接近或略低于稻瘟病抗性亲本和褐飞虱抗性亲本。部分改良恢复系及其测交种对白叶枯病表现为抗病或中抗，改良恢复系及其测交种在正常条件下农艺性状与原始恢复系及其测交种相仿或更优，具有生产应用价值；邹声浩[218]利用MAS技术将抗稻瘟病基因Pi9和Pid2以及抗褐飞虱基因Bph14和Bph15导入两系不育系03S中，选育出与03S表现型相似且抗性良好的单株，改良了两系杂交稻不育系的抗性。张晓[219]将具有抗褐飞虱双基因Bph14和Bph15以及抗螟虫基因Cry1Ab/Ac的中籼品系07WH3009作为供体亲本，以优质、高产、株型好、配合力强等农艺性状优良的华1176、华261、华恢910和华恢729作为受体亲本，选育出1批含有抗褐飞虱双基因、单基因的中间材料；胡巍等[220]利用MAS和连续回交的方法，将来源于栽培稻的抗褐飞虱基因Bph3、来源于野生稻的抗褐飞虱基因Bph14和Bph15分别转入到华南高产水稻品种桂农占中，褐飞虱抗性评价结果表明，在含单个抗性基因的株系中，含抗性基因Bph3的株系抗性水平最高，含抗性基因Bph14的株系抗性水平最低，而含Bph14和Bph15双基因株系的抗性水平高于含单个基因株系的抗性水平；王金明等[221]利用水稻抗稻瘟病基因Pi40和Pib的特异PCR标记，对含有Pi40和Pib水稻品系复合杂交F2的50个植株进行检测，从中选择到Pi40和Pib的双基因聚合抗病植株28个；Hasan等[222]将3个抗稻瘟病基因Pi-7（t）、Pi-d1（t）和Pir2-3（t）以及 1个抗稻瘟病数量性状位点（QTL）qLN2成功导入到马来西亚的优良品种MR263中，增强了MR263对稻瘟病的抗性；杜太宗等[223]通过MAS技术将稻瘟病抗性基因Pi1和Pi9聚合到金23B中并进行田间自然诱发鉴定，成功发现对叶瘟和穗颈瘟抗性提高的聚合材料；Ji等[224]将3个抗稻瘟病基因（Pi1、Pi2、Pita）、2个抗白叶枯病基因（Xa23、Xa5） 和1个抗褐飞虱基因（Bph3） 聚合到同一品种中，得到1份同时含有3种抗性基因的新品系，随后进行了2 a的种植试验，结果证明聚合了3种抗性基因的新品系对3种病虫害的抗性明显增强；Hu等[225]利用分子标记辅助回交选择方法将3个抗褐飞虱基因聚合到华南的籼稻品种Hemeizhan（HMZ）中，得到的品系表现出了很强的抗性，同时发现，聚合的基因个数与抗性水平呈正相关（Bph3＋Bph14＋Bph15≥Bph3＋Bph15≥Bph3＋Bph14≥Bph14＋Bph15≥Bph3≥Bph15≥Bph14＞无），选育出的水稻抗褐飞虱新品系对于提高其他栽培品种的抗性是良好的中间材料。

以上研究表明，水稻中抗病虫基因的多样化是应对生物型或小种变异的重要措施，是增强水稻品种广谱和持久抗性的重要基础。

5 问题与展望

随着分子生物学新成果和新技术的不断出现，以及基因组学和生物信息学等学科的深入研究，MAS技术渐渐成为了目前育种工作的有利手段。目前，我国在水稻抗病虫研究上基础研究较多，具体的品种选育研究较少[226]，虽然在水稻抗病虫基因的鉴定、分子作图和利用、生物型变异以及培育抗病虫品种等方面已取得了很大进展，但是也出现了很多问题：（1）MAS并不像当初设想的那么广泛，基因的发掘数量不够大，遗传信息联系不够紧密，容易受到遗传背景的影响，而且，有一些基因的定位不够精确，单一的抗病虫品种寿命短，易诱发形成新的小种或生物型，使品种的抗性丧失；（2）基因克隆的进度缓慢，难以满足育种者对基因的需求。因此，在水稻抗病虫育种上应不断挖掘抗谱广、抗性强的基因。加之现有的抗性基因的分子标记在一些育种群体没有多态性，所以，应该加强水稻抗性基因紧密连锁标记的开发，使育种家对分离群体的选择更加准确，提高育种效率[227]。

另外，在抗病虫育种方面，经过多年的验证，由单基因控制的水稻品种易受小种或生物型的变化而失去作用。一般认为，微效多基因的利用有助于保持水稻对病虫害的持久抗性，但这方面的研究还相对较少，研究基础比较薄弱[228]。

因此，需要持续、深入、系统地了解水稻生长发育的分子机制，完善现有分子育种相关的种质资源信息系统，结合分子标记辅助选育与水稻分子设计，培育具有广谱和持久抗性的水稻新品种，进而减轻抗性品种对病虫害的选择压力。同时，增加品种的广谱和持久抗性也是目前水稻抗病虫分子育种发展的主要方向。