水溶性超高效聚合物色谱法测定木质素磺酸盐分级分离产物的相对分子质量分布

钱 晨, 方红霞, 蔡 群, 蔡 方, 高新宇, 李丹丹

(黄山学院应用化学研究所, 安徽 黄山 245041)

木质素是为数不多的能提供巨量芳烃化合物的天然产物,它是由苯丙烷单体通过醚键以及碳-碳单键相连构成的复杂高分子[1]。木质素磺酸盐来自制浆造纸废液,磺酸基团决定了其具有良好的水溶性,作为一种聚电解质,它们具有表面活性剂性质,可以作为助剂广泛应用在建筑、农业和轻工等行业[2,3]。由于具有较宽的相对分子质量分布范围,木质素磺酸盐不同级份的结构和性能差异较大,目前通常采用透析法、超滤法、溶剂分馏法和制备色谱法等技术对其进行分级分离,以期提高其应用性能和拓展其应用范围[4-6]。

快速准确地测定不同级分木质素的平均相对分子质量及其分布是评价分级分离效果的重要指标之一。凝胶色谱法是一种基于体积排除原理的测试方法,以有机溶剂为流动相的称为凝胶渗透色谱(GPC),而以水相溶液为流动相的称为凝胶过滤色谱(GFC)。由于凝胶色谱法可以同时测定物质的相对分子质量及其分布,是目前测定高聚物相对分子质量的首选方法[7-9],已被广泛应用在分析测试木质素相对分子质量的研究中[10-12]。传统凝胶色谱采用5 μm或者大于5 μm粒径的凝胶柱,有机相和水相都易使其产生溶胀和腐蚀现象。此类凝胶柱无法耐受高压,分辨率低,重现性较差,且单针运行时间较长。木质素磺酸盐等亲水性强的样品不溶于有机溶剂,也无法进行甲基化或乙酰化反应,只能在亲水性聚合物色谱柱上用水溶性流动相淋洗;为了克服离子排斥、吸附等非体积排阻因素的影响,大多需要采用复杂的色谱条件进行分析,一直未能获得较为理想的测试结果[13,14]。

近年推出的超高效聚合物色谱法(APC),由于采用一种亚3 μm、刚性杂化颗粒填料的色谱柱,具有分析速度快、吸附低、耐高压、耐溶剂、稳定性好、重现性高等优点[15-17],特别是在测试低聚物时具有分辨率高的优势,为木质素磺酸盐及其分级分离产物的分析提供了很好的技术条件。近期,本课题组[18]初步建立了采用APC水性柱分析酸催化木质素磺酸盐解聚前和解聚后残渣相对分子质量的方法,直观地证实了木质素被解聚后残渣的相对分子质量及其分布性质。同时,在实验中也发现,由于其聚电解质性质,离子排斥、吸附等非体积排阻效应仍不可忽略,一定程度上影响了测试结果的分辨率和稳定性。本文在以上分析工作的基础上,进一步优化和探索采用水溶性超高效聚合物色谱高效分离和解析水溶性天然高分子木质素磺酸盐及其分级分离产物的方法,为木质素及其分级分离产物的表征、性能研究提供科学可行的方法途径。

1 实验部分

1.1 仪器、试剂及原料

超高效聚合物色谱系统:ACQUITY APC等度溶剂管理器,ACQUITY APC样品管理器,ACQUITY单区间柱管理器,ACQUITY示差(RI)检测器(美国Waters公司)。

葡聚糖窄分布标准品(简称标准品,美国Waters公司),峰位相对分子质量(Mp)为180～4.015×105Da。超滤杯、再生纤维素超滤膜(德国Amicon公司),木质素磺酸钠(工业级,阿拉丁公司),其他试剂均为国产色谱纯。高纯水由Millipore Rios 50型去离子水机(德国Millipore公司)制备后经Millipore A10纯水机(德国Millipore公司)纯化。

1.2 木质素磺酸盐超滤组分的制备

配制质量分数为5%的木质素磺酸盐水溶液,过滤去除不溶物,分别选用截留相对分子质量为1×104和3×104Da的再生纤维素超滤膜对木质素磺酸盐溶液进行超滤分级分离,得到3种不同相对分子质量分级组分的木质素磺酸盐:组分1(截留相对分子质量大于3×104Da)、组分2(截留相对分子质量小于3×104Da、大于1×104Da)和组分3(截留相对分子质量小于1×104Da)。分级样品经旋蒸浓缩后、冷冻干燥得到固体粉末样品。

1.3 APC实验条件

选用3根水相色谱柱(AQ)串联进行测试,分别是45 nm色谱柱(有效相对分子质量范围为2×104～4×105Da, 150 mm×4.6 mm, 2.5 μm)、20 nm色谱柱(有效相对分子质量范围为3×104～7×104Da, 150 mm×46 mm, 2.5 μm)和4.5 nm色谱柱(有效相对分子质量范围为2×102～5×103Da, 150 mm×4.6 mm, 1.7 μm)。流动相:0.1 mol/L NaNO3水溶液;柱温:40 ℃;示差折光检测器:40 ℃;流速:0.5 mL/min;进样量:10μL;待测样品含量:0.5%(质量分数)。

1.4 APC测试方法

采取单标进样方式,即选取系列葡聚糖标准品,分别用流动相溶解,于室温下静置12 h,置于自动进样瓶中进样测试,并用葡聚糖标准品作APC标准曲线,标准溶液含量为0.5%(质量分数)。用流动相溶解木质素磺酸盐和分级分离后的木质素,于室温下静置12 h后过0.45 μm水相滤膜,置于自动进样瓶中,使用宽分布未知样法进行测试。

2 结果与讨论

2.1 色谱条件的优化

2.1.1流动相的影响

APC采用小颗粒亚乙基桥杂化二氧化硅改性凝胶色谱柱,虽然相比于凝胶聚合物色谱柱,具有出色的柱效、低吸附、巨大的机械稳定性等优点,然而由于木质素磺酸盐的电解质特性,使其在色谱柱中进行分离时并非只有单纯的体积排阻作用,故有可能导致结果偏差。消除非体积排阻效应可以通过调节流动相pH值和离子强度来实现。

首先研究了流动相pH值对测试结果的影响,结果如图1所示,使用pH 9.0的NaOH溶液为流动相,木质素磺酸盐样品色谱峰出峰时间大大提前,且分离效果很差,这可能是在高pH值下,离子排除效应增强的结果。采用pH 3.0的甲酸溶液作为流动相,色谱峰出现了分离,但色谱峰出峰时间整体延后,说明样品在色谱柱上产生了吸附,这和文献[19,20]的描述是一致的。而采用pH 7.0的纯水作为流动相,虽然开始能得到分离度较好的谱图,但色谱柱经过几次使用,色谱峰的数目和面积都会减少,说明木质素磺酸盐样品仍会在色谱柱上产生吸附,因此进一步考虑在纯水中加入盐离子来进行调节。

图 1 不同pH值流动相测得的木质素磺酸盐的APC图谱

在参照文献和前期研究的基础上[18,21],采用近中性的不同浓度NaNO3水溶液作为离子强度不同的流动相进行了测试。结果如表1所示,在pH值相同时,随着流动相离子强度的升高,色谱峰面积逐渐增大,这表明离子强度的升高有利于减少木质素磺酸盐在色谱柱上的吸附。同时,随着离子强度的升高,色谱峰的保留时间也略有延长,说明离子强度的增加也能减小木质素分子在流动相中的膨胀以及木质素分子间的排斥。但离子强度较高时,系统的运行压力升高,不利于试验的进行。综合上述结果,选用pH 6.8的0.1 mol/L NaNO3水溶液作为流动相。

表 1 不同离子强度的流动相对木质素磺酸盐APC测试数据的影响

Time: the retention time of the highest peak. Area: the area of the whole chromatogram.

2.1.2流速及进样量的影响

首先考察了流动相流速为0.3、0.5和0.8 mL/min时对木质素磺酸盐样品分离度的影响,3种流速下木质素磺酸盐样品均能进行有效分离。当流速为0. 3 mL/min时,所需分析时间较长;当流速为0.8 mL/min时,分析时间较短但系统运行压力较高,且色谱峰的分辨率有所下降,因此选择0.5 mL/min作为测试流速。传统凝胶色谱中3根色谱柱串联分析1个样品需要30 min以上[19],而在该条件下,分析1个样品所需时间仅为12 min,大大缩短了分析时间。同时还考察了样品进样量的影响。将木质素磺酸盐配成质量分数为0.5%的样品,进样量分别为20、10、5和2.5 μL,在不同的进样量下,样品的出峰时间基本不变,说明进样量对木质素磺酸盐样品的分离效果影响不明显,因此选定10 μL为测试进样量。

2.2 标准曲线的绘制

在以pH 6.8的0.1 mol/L NaNO3水溶液为流动相,采用3根Waters水溶性色谱柱串联,进样量为10 μL,流速为0.5 mL/min的条件下,同时考虑到木质素磺酸盐的亲水性及其官能团多样、成分复杂等特点,选用葡聚糖作为标准品,用流动相溶解系列葡聚糖标准品进行了标准曲线的绘制。标准品测试结果显示,不同相对分子质量的葡聚糖标准品经过串联色谱柱得到了有效且快速的分离,出峰时间随着相对分子质量的递减而递增,其相对分子质量与对应的出峰时间见表2。以相对分子质量的对数为纵坐标,出峰时间为横坐标,由Waters APC自带的Empower软件拟合得到标准曲线,其曲线判定系数r=0.999 8,该标准曲线的相对分子质量测试范围为180～4.015×105Da,能满足木质素磺酸盐及其分级产物相对分子质量的测试要求。

表 2 葡聚糖标准品的峰位相对分子质量及保留时间

图 2 木质素磺酸盐的APC图谱

2.3 木质素磺酸盐及其膜分离产物的测试

2.3.1木质素磺酸盐的相对分子质量及其分布

用流动相溶解木质素磺酸盐配成0.5%(质量分数)的待测液,按1.3节方法进行测试,结果表明,该木质素磺酸盐的数均相对分子质量(Mn)为2 245 Da,重均相对分子质量(Mw)为18 934 Da,聚合物分散性指数(polymer dispersity index, PDI)为8.44,分布较宽。从图2可以看出,相比纯水流动相(见图1b)以及先前报道方法[18]的测试结果,本试验由于采用了pH 6.8的0.1 mol/L NaNO3水溶液为流动相,降低了离子排斥和吸附等非体积排阻效应的影响,木质素磺酸盐的色谱图具有更多的精细结构。经过色谱分离后该木质素磺酸盐的相对分子质量分布在8个区间,相对分子质量从几百到几万。从表3可以看出,每个区间的PDI都在1.0～1.2之间,说明在此实验条件下,木质素磺酸盐在色谱柱中实现了高效的分离。

表 3 木质素磺酸盐的相对分子质量及其分布指数

Mw: weight average relative molecular mass;Mn: number average relative molecular mass.

2.3.2水溶性APC检测木质素磺酸盐的重现性

为了验证APC测试方法的重现性,分别在3天内对同一木质素磺酸盐样品进行了测试,由表4可知,3次测试的木质素磺酸盐的Mw、Mn和PDI数值变化不大,其对应的RSD数值都小于1,相对于传统凝胶色谱5%左右的RSD有较大提升[18]。由此可见该方法测试木质素磺酸盐具有很好的重现性。

表 4 木质素磺酸盐平均相对分子质量及其分布指数的重现性

2.3.3木质素磺酸盐的膜分离产物的相对分子质量及其分布

采用1.3节所述的超滤组分的制备技术对木质素磺酸盐进行膜分离,膜分离时的溶液质量分数为5%,实验分别截留了3个分离组分,分别为相对分子质量在3×104Da以上组分、相对分子质量为1×104～3×104Da的组分和相对分子质量在1×104Da以下的组分。收集器中截留液的颜色随截留相对分子质量的降低逐渐变浅,采用APC分析了木质素磺酸盐膜分离的3个截留样品的相对分子质量及其分布,结果见图3和表5。从图3中可以看出,APC对分级分离产物的测试具有很高的分辨率,3个组分的Mn分别为40 410、12 208和1 516 Da,其分散指数分别为2.09、2.80和2.51。APC分离分析结果表明,采用超滤方法分离木质素磺酸盐获得了很好的效果,APC方法是一种指导和优化膜分离技术的有效表征手段。

图 3 超滤膜分离后的木质素磺酸盐各组分的APC谱图

表 5 超滤膜分离后的木质素磺酸盐的平均相对分子质量及其分布指数

3 结论

本文系统考察了流动相pH值、离子强度等测试条件对超高效聚合物色谱分析水溶性高分子相对分子质量的影响。在此基础上,初步研究了影响APC分析结果的离子排斥和吸附等非体积排阻效应机制,建立了精细相对分子质量结构信息的木质素磺酸盐的APC测试方法。采用该方法表征超滤分级分离的木质素磺酸盐组分,证明了超滤法对木质素磺酸盐实现了高效分离,为后期分级分离产物的高效应用研究建立了基础。本研究将促进复杂天然高分子木质素磺酸盐的精细化应用(分级分离以及解聚产物等)研究,也为其他天然高分子产物的结构性能研究提供了新的方法路径。