超高效液相色谱-串联质谱法测定茶叶、代用茶和饮料食品中63种非法添加化合物

唐维英, 黄泽玮, 钱广生, 魏宇涛, 黄 瑛, 徐小平, 余晓琴*

(1. 四川省食品药品检验检测院, 四川 成都 610097; 2. 四川大学华西药学院, 四川 成都 610041)

非法添加是指使用食品添加剂以外的任何化学物质和可能危害人体健康的物质[1],其中非法添加的具有解热镇痛效果的化合物主要有糖皮质激素、非甾体抗炎药、抗组胺药和抗生素[2]等化合物,这些药物通过各种途径产生解热镇痛的效果[3]。近年来,随着国家食品药品监督管理机构加大力度对保健品的监督检查,不法商家开始将非法添加转至普通食品中,其形式多样、检测分析难度大,如近年来发现的配制酒中添加壮阳类化合物,咖啡中添加减肥类化合物等[4],同时添加的形式和手段也由过去单一的较大量添加变成混和的较少量添加,或添加某种药物的先导化合物或者改造物[5],单一的某种药物不足以对人体造成伤害,但多种相同效果的药物同时作用会对人体造成相同甚至更严重的伤害[6]。由于缺乏快速有效的检测方法,食品中非法添加化合物的检测面临严峻挑战。

国内关于解热镇痛效果化合物的检测,前期的主要依据是补充检验方法《抗风湿类中成药补充检验方法和检验项目批准件2009025》,其主要针对中成药,能检测的化合物仅有13个,需要分几个检测系统分别进行定性和定量检测,分析方法繁琐、效率低、检测种类有限。因此,研究出一种应用范围更广、检测化合物更多、更易操作的关于食品中非法添加的具有解热镇痛效果化合物的检测方法尤为重要。目前非法添加检测的手段主要有薄层色谱法[7]、高效液相色谱法[8,9]、高效液相色谱-质谱联用法[10-15]、液相色谱-核磁联用法[16]等。其中超高效液相色谱-串联质谱法最为普遍,该方法可实现同时定性定量,高灵敏度检测,并且适用性强,适于推广。

本文采用超高效液相色谱-串联质谱仪,以茶叶、代用茶和饮料作为基质,建立了一种快速、有效检测食品中63种非法添加化合物的分析方法,为以后食品中非法添加化合物的分析测定奠定了基础。

1 实验部分

1.1 仪器、试剂和材料

Agilent 1290超高效液相色谱仪和Agilent 6460四极杆质谱仪(美国Agilent公司); XS105电子分析天平(瑞士Mettler公司); AS20500B超声清洗机(天津Auto science公司); MS3 digital涡旋仪(德国IKA公司); Milli-Q超纯水系统(美国Millipore公司)。

曲安西龙(triamcinolone)、泼尼松龙(predni-solone)、氢化可的松(hydrocortisone)、泼尼松(prednisone)、倍他米松(betamethasone)、地塞米松(dexamethasone)、氟米松(flumethasone)、倍氯米松(beclomethasone)、氢化可的松醋酸酯(hydrocortisone acetate)、地夫可特(deflazacort)、甲基泼尼松龙醋酸酯(methylprednisolone acetate)、曲安奈德醋酸酯(triamcinolone acetonide acetate)、倍他米松戊酸酯(betamethasone valerate)、哈西奈德(halcinonide)、安西奈德(amcinonide)、美洛昔康(meloxicam)、双氯芬酸钠(diclofenac)、对乙酰氨基酚(paracetamol)、保泰松(phenylbutazone)、吡罗昔康(piroxicam)、甲氧苄啶(trimethoprim)、氨基比林(aminophenazone)、地西泮(diazapam)、氯苯那敏(chlorpheniramine)、罗通定(rotundine)、舒林酸(sulindac)、甲芬那酸(mefenamic acid)、安替比林(antipyrine)、异丙安替比林(propyphenazone)、非那西丁(phenacetin)、萘丁美酮(nabumetone)、苯海拉明(diphenhydramine)、磺胺甲恶唑(sulfametho-xazole)购自中国食品药品检定研究院,甲基泼尼松龙(methylprednisolone)、曲安西龙双醋酸酯(triamcinolone diacetate)、氟氢缩松(flurandrenolide)、泼尼松龙醋酸酯(prednisolone acetate)、氟米龙(fluoromethalone)、倍他米松醋酸酯(betamethasone acetate)、地塞米松醋酸酯(dexamethasone acetate)、布地奈德(budesonide)、氢化可的松丁酸酯(hydrocortisone butyrate)、氟米龙醋酸酯(fluorometholone acetate)、氢化可的松戊酸酯(hydrocortisone valerate)、氟轻松醋酸酯(fluocinonide)、二氟拉松双醋酸酯(diflurasone diacetate)、泼尼卡酯(prednicarbate)、阿氯米松双丙酸酯(alclomethasone dipropionate)、莫米他松糠酸酯(mometasone furoate)、倍氯米松双丙酸酯(beclometasone dipropionate)购自美国药典委员会,可的松(cortisone)、氟氢可的松醋酸酯(fludrocortisone acetate)、泼尼松醋酸酯(prednisone acetate)、依托考昔(etoricoxib)购自加拿大Toronto Research Chemicals公司,可的松醋酸酯(cortisone acetate)、曲安奈德(tramcinolone acetonide)、氯倍他索丙酸酯(clobetasol propionate)、倍他米松双丙酸酯(betamethasone dipropionate)、芬布芬(fenbufen)、酮洛芬(ketoprofen)购自德国Dr. Ehrenstorfer公司,氟替卡松丙酸酯(fluticasone propionate)、塞来昔布(celecoxib)、氯倍他松丁酸酯(clobetasone butyrate)购自European Pharmacopoeia Reference Standard公司,以上化合物纯度均大于97%。甲醇、乙腈和乙酸铵(色谱纯,美国Fisher Scientific公司);甲酸铵(色谱级,美国Fisher Scientific公司),甲酸(色谱级,德国CNW公司)。所用水均为Milli-Q超纯水系统制备。样品均购自网络。

1.2 对照溶液的配制

分别精密称取上述对照品各10 mg,以甲醇溶解,在10 mL容量瓶中以甲醇定容至刻度,配制成质量浓度为1 g/L的对照储备液。分别精密移取安替比林、罗通定、氨基比林、保泰松、吡罗昔康、美洛昔康、苯海拉明、非那西丁、磺胺甲恶唑、甲氧苄啶、氯苯那敏、依托考昔、异丙安替比林、布地奈德、倍氯米松双丙酸酯、倍他米松双丙酸酯、泼尼卡酯、氟米龙醋酸酯、倍他米松戊酸酯、甲基泼尼松龙、曲安西龙双醋酸酯、曲安奈德、氯倍他索丙酸酯、曲安奈德醋酸酯对照储备液10 μL;舒林酸、对乙酰氨基酚、氟轻松醋酸酯、二氟拉松双醋酸酯、氟替卡松丙酸酯、阿氯米松双丙酸酯、地西泮、泼尼松龙醋酸酯、氢化可的松丁酸酯、安西奈德、莫米他松糠酸酯、氯倍他松丁酸酯、泼尼松龙、可的松、倍他米松、地塞米松、氢化可的松戊酸酯对照储备液25 μL,氢化可的松、泼尼松、氟米松、倍氯米松、酮洛芬、氟米龙、地夫可特、氢化可的松醋酸酯、甲基泼尼松龙醋酸酯、泼尼松醋酸酯、可的松醋酸酯、倍他米松醋酸酯、地塞米松醋酸酯、甲芬那酸对照储备液50 μL,曲安西龙、氟氢缩松、氟氢可的松醋酸酯、哈西奈德、芬布芬、萘丁美酮、塞来昔布、双氯芬酸对照储备液250 μL,置于同一50 mL容量瓶中,以甲醇定容,配制成混合对照中间液。置于-20 ℃冰箱中储存备用,数据采集时用甲醇稀释至相应的浓度。

1.3 样品的制备

精密称取研磨后混匀的代用茶、茶叶或摇匀的液体饮料1 g,置于50 mL量瓶中,加入甲醇约40 mL,涡旋2 min,超声30 min,放冷至室温,用甲醇定容至刻度,摇匀,过微孔滤膜(0.22 μm,尼龙膜),取滤液,供液相色谱-质谱联用仪分析。

1.4 色谱条件

色谱柱:Thermo Acclaim RSLC C18(100 mm×2.1 mm, 2.2 μm);柱温:30 ℃;进样量:2 μL;流动相:A为5 mmol/L甲酸铵溶液(含0.1%(体积分数,下同)甲酸), B为0.1%甲酸乙腈。梯度洗脱程序:0～1 min, 5%B; 1～17 min, 5%B～37%B; 17～27 min, 37%B～85%B; 27～28 min, 85%B～95%B; 28～31 min, 95%B; 31～33 min, 95%B～5%B; 33～36 min, 5%B。

1.5 质谱条件

离子源:ESI;检测方式:动态多反应监测(dMRM);电离电压:4.0 kv(正离子扫描);干燥气流速:7 L/min;干燥气温度:325 ℃;鞘气流速:11 L/min;鞘气温度:350 ℃;雾化器流量:276 kPa。化合物定性、定量离子及其他质谱参数见表1。

表 1 63种化合物的质谱参数

表 1 (续)

表 1 (续)

Product ion 2: quantitative ion. CE: collision energy.

2 结果与讨论

2.1 色谱条件的优化

研究考察了Thermo Accucore XL C18(100 mm×2.1 mm, 4 μm)、Thermo Acclaim RSLC C18(100 mm×2.1 mm, 2.2 μm)和Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18(50 mm×2.1 mm, 1.8 μm)3款色谱柱对待测化合物的分离效果。比较了0.1%乙酸-乙腈、10 mmol/L乙酸铵溶液(含0.1%乙酸)-0.1%乙酸乙腈和5 mmol/L甲酸铵溶液(含0.1%甲酸)-0.1%甲酸乙腈3种流动相对分离效果的影响,并进行了梯度优化。结果表明,采用2.2 μm Thermo Acclaim RSLC C18柱,以5 mmol/L甲酸铵溶液(含0.1%甲酸)-0.1%甲酸乙腈进行梯度洗脱时,63种化合物的响应值和峰形均较好,包括同分异构体倍他米松和地塞米松在内的63种化合物均可获得较好的分离。

在ESI+模式下对0.3 μg/L的63种化合物混合对照溶液进行质谱扫描分析,得到每种化合物的分子离子峰[M+H]+,以分子离子峰为母离子,对其进行二级质谱扫描,优化每种化合物母离子和子离子所需的毛细管出口电压和碰撞能量,优化后的质谱参数见表1。63种化合物在优化后的色谱-质谱条件下分离效果较好,灵敏度较高,63种化合物混合标准溶液(0.3 μg/L)的总离子流色谱图见图1。

图 1 63种化合物混合标准溶液(0.3 μg/L)的总离子流色谱图

2.2 前处理方法的优化

在前期研究中,最先尝试有机试剂超声提取的方法,但发现出峰时间靠前的甲氧苄啶、对乙酰氨基酚、氨基比林等化合物的回收率偏低(20%～40%),为解决这些化合物回收率偏低的问题,将梯度放缓,采集时间延长至35 min,缓解了63种化合物与基质共流出的问题,从而使保留时间靠前的化合物的回收率有明显改善。考察了甲醇、乙腈、50%甲醇和80%甲醇的提取效果,结果发现4种溶剂提取后,各化合物的回收率无显著差异,且甲醇提取回收率更接近理论值,详见图2。通过对阳性样品的提取比较,结果无明显差异。考虑操作方便、成本、环保和对实验人员的健康影响(乙腈毒性比甲醇大)等因素,选择甲醇作为提取溶剂。

图 2 4种提取溶剂对目标化合物回收率的影响

2.3 基质效应的评价

研究主要针对饮料、茶叶及相关制品类成分复杂的食品,该类产品可能存在较强的基质效应,而基质效应(ME)主要是由于样品在离子化时基质成分与目标化合物相互竞争电离所致,包括基质增强效应和基质抑制效应。采用ME=(基质匹配标准曲线的斜率/溶剂标准曲线的斜率)×100%的计算方法对63种化合物的基质效应进行评价。一般来说,当ME在80%～120%之间时,表明基质效应不明显,在实际检测中可忽略不计;反之则应考虑基质效应的影响,在实际检测中应采用基质标准曲线[17]。由表2可知,各基质中ME在80%～120%之间的化合物所占比例为:茶叶56%(35/63)、代用茶59%(37/63)、饮料79%(50/63),说明茶叶和代用茶基质效应更为明显;部分化合物检测会受到基质效应的影响。为了能更准确地测定目标化合物,本试验采用基质匹配标准曲线来消除基质效应。

2.4 方法学验证

2.4.1定量限、标准曲线、线性范围

在GB 5009.1-2017《食品安全国家标准食品理化检验方法总则》征求意见稿中,定量限定义为样品中被测物能被定量测定的最低限,其测定结果应满足该最低量时准确度和精密度要求。在保证准确定性的前提下,通过使用空白基质逐级稀释对照品溶液来考察定量限,最终在保证线性良好、精密度<15%、绝大部分化合物回收率在80%～120%的前提下,63个化合物的定量限为0.10～2.50 mg/kg,详见表2。

配制63种化合物的系列混合标准溶液,采用空白样品基质提取液配制系列基质匹配混合标准溶液,在已优化的色谱与质谱条件下,绘制标准曲线,以峰面积(y)与相对应的质量浓度(x, μg/L)作图,并计算各待测物线性回归方程及其相关系数。在相应的质量浓度范围内,63种化合物的线性关系良好,相关系数R2均在0.99以上,具体线性关系参数见表2。

表 2 63种化合物在纯溶剂和3种不同基质中的线性范围、线性方程、相关系数、基质效应和定量限

表 2 (续)

表 2 (续)

表 2 (续)

表 2 (续)

y: peak area;x: mass concentration, μg/L.

2.4.2准确度、重复性和进样精密度

以3种食品基质饮料、茶叶及代用茶作为代表基质,进行添加回收试验。按照定量限的1、2、5倍进行添加水平试验,各水平制样6份。以测出量对理论添加量的百分比值计算平均回收率;每水平进行了6次平行实验,以测出量的RSD表示方法重复性;取2倍定量限水平的样品连续进样6针,以测出量的RSD表示进样精密度。由表3可知,63种化合物各添加水平平均回收率为62.4%～129.4%,重复性、进样精密度的RSD值为0.3%～9.6%,方法的准确度、重复性和精密度均基本满足定量分析的要求。

表 3 3种基质中63种化合物的回收率、进样精密度和重复性(n=6)

表 3 (续)

表 3 (续)

表 3 (续)

2.4.3稳定性

分别配制茶叶、代用茶和饮料3种基质的低水平加标溶液1份,放置0、1、2、4、8、12和24 h后分别进行测定,以峰面积计算63种化合物在3种基质中0～12 h和0～24 h的相对标准偏差RSD,在12 h内,3种基质中63种化合物的RSD均<15%; 24 h时凉茶饮料基质中部分化合物(5/63)的RSD普遍增高(≥20%)。结果说明,在12 h内,3种基质供试品溶液的稳定性满足定量分析的要求。

2.4.4实际样品的测定

利用建立的方法,对网上宣称具有解热镇痛作用的83批代用茶和凉茶饮料进行检测,发现阳性样品8批次,详细结果见表4。

表 4 实际样品测定结果

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3 结论

本研究建立了超高效液相色谱-串联质谱检测茶叶、代用茶和饮料中63种化合物的分析方法。该方法样品前处理简单,分析速度快,灵敏度、准确度、精密度、重复性和稳定性良好,能满足同时测定食品中63种化合物的要求。该方法已经被国家食品药品监督管理总局收录为补充检验方法,有望在食品非法添加物的检测中发挥重要作用。