TACC2/p300/HIF-1α信号通路对结直肠癌增殖影响的研究

彭 洪，林中超

(四川省南充市中心医院中西医结合肛肠科，四川 南充 637000)

结直肠癌在全世界范围内是排名第三的恶性肿瘤。每年有接近130万新诊断病例，并且每年有70万人因为结直肠癌而死亡。虽然近年来西方国家结直肠癌的发病率和死亡率有所下降，但是在中国和其他一些发展中国家，发病率和死亡率却有所上升。因此，阐明其具体作用机制对于结直肠癌的早期诊断和治疗至关重要。TACC2(transforming acidic coiled-coil proteins 2)是TACC蛋白家族成员之一，其主要位于中心体，可调控微管蛋白的形成和调控细胞有丝分裂，因此对于染色体的稳定具有重要作用[1]。如果TACC2蛋白表达出现变化，可能导致基因稳定性降低甚至形成肿瘤[2]。也有研究发现TACC2可与核组蛋白甲基转移酶共同作用参与基因转录调控[3]。有研究报道TACC2基因的高表达与乳腺癌和前列腺癌的发病密切相关[4，5]。然而TACC2基因在结直肠癌中的表达及与结直肠癌发生发展的关系及作用机制尚未见报道。小干扰RNA(siRNA)可通过沉默目标基因来发挥作用，因此本研究采用RNA干扰技术抑制结直肠癌中TACC2基因的表达，探讨TACC2在结直肠癌增殖中的作用和其可能的作用机制。

1 材料和方法

1.1材料人结直肠癌细胞系LoVo、HCT116及SW480细胞，均购自重庆医科大学基础研究所。2016年2月至2017年10月，收集在南充市中心医院行根治性手术的20例结直肠癌患者的癌组织标本及匹配的癌旁正常组织，所有组织标本均经病理切片证实为原发性结直肠癌。所有结直肠癌手术患者术前未接受其他抗肿瘤治疗。

1.2方法

1.2.1TACC2在结直肠癌和癌旁组织中的表达 将收集的肿瘤组织和癌旁组织标本粉粹后放于EP管中，加入细胞裂解液，混匀并冰置15 min，然后离心20 min(4 ℃，10000 g)，收集的上清液为细胞总蛋白。蛋白免疫印迹法(Western Blot)用于检测TACC2蛋白的表达，其具体操作方法参照前期文献。Quantity One 软件用于分析TACC2蛋白表达水平。

1.2.2高表达TACC2蛋白的结直肠癌细胞系的筛选 蛋白免疫印迹法用于检测人结直肠癌细胞系LoVo、HCT116及SW480细胞中TACC2蛋白的表达。

1.2.3TACC2 siRNA的设计和转染 根据TACC2基因序列和小干扰RNA设计原则，设计TACC2 siRNA序列如下：sense 5’-GCU AAA GGU ACU UAC ACC UUG AUA-3’，antisense 5’-UAU CAA AGG UGU AAG UAC CUU UAG C-3’。同时设计合成与TACC2基因无同源性的阴性对照组siRNA-NC： sense 5’-CAA UAC GUA CUA UCG CGC GGA UTT-3’，antisense 5’-AUC AAA CGC GCG ATA GUA CGU ATT-3’，并设置空白对照组Blank，委托广州莱博生物科技有限公司合成。利用腺病毒将TACC2 siRNA，siRNA-NC转染入LoVo细胞。

1.2.4荧光定量聚合酶链式反应(PCR)检测TACC2基因的表达 用PCR法检测TACC2 siRNA，siRNA-NC和Blank组细胞中TACC2基因的表达，具体操作步骤参考前期文献。TACC2的上游引物：5’-AGC CAG CGA CCT GAA CCT-3’，下游引物： 5’-GAG GTC AGC ACA CAG CCA C-3’。GAPDH的上游引物：5’-CAT GCA GGC TAC CAT CCA TGT-3’，下游引物： 5’-GTT AGC AGT GAT GCC TAC CAA-3’。结果提示TACC2 siRNA沉默基因的效果最强。采用相对定量比较CT值法分析数据。

1.2.5MTT检测细胞增殖能力 将转染TACC2 siRNA，siRNA-NC和Blank组的结直肠癌 LoVo细胞系以每孔2×104个接种于96孔板，每组4个复孔，培养24小时及48小时后每孔加MTT 20ul，4 h后弃上清液。然后每孔加二甲基亚砜(DMSO)150ul，震荡10分钟后于490 nm处测定吸光度(A)值。实验重复进行3次。

1.2.6TACC2下游基因的筛选 为进一步研究TACC2基因调控细胞增殖的具体作用机制，我们从Pubmed Gene上搜索可与TACC2相互作用的下游基因，发现p300可与TACC2相互作用。

1.2.7TACC2对p300基因表达的影响 将转染TACC2 siRNA和Blank组的结直肠癌 LoVo细胞以每孔2×105个接种于6孔板过夜。48小时后收集各组细胞，进行免疫印迹分析。p300蛋白的表达用Quantity One图像分析软件进行吸光度分析。

1.2.8TACC2对结直肠癌 LoVo细胞p300组蛋白乙酰转移酶(histone acetyltransferase，HAT)活性的影响 将转染TACC2 siRNA和Blank组的结直肠癌 LoVo细胞以每孔2×105个接种于6孔板过夜。48小时后收集各组细胞，应用活性光度法检测p300-HAT活性，观察TACC2对结直肠癌 LoVo细胞p300-HAT活性的影响。

1.2.9TACC2对缺氧诱导因子(hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α)表达的影响 将转染TACC2 siRNA和Blank组的结直肠癌 LoVo细胞以每孔2×105个接种于6孔板过夜。48小时后收集各组细胞，进行免疫印迹分析。HIF-1α蛋白的表达用Quantity One图像分析软件进行吸光度分析。

1.3统计学方法所有数据使用SPSS 17.0软件进行分析。定性变量用计数(%)表示，定量变量用均数±标准差表示。计量资料符合正态分布的采用t检验，不符合正态分布的采用Mann-Whitney秩和检验。三组以上的数据采用单向方差分析。P< 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1TACC2蛋白在不同组织中表达水平比较TACC2蛋白在结直肠癌组织中的表达水平明显高于癌旁正常组织，差异有统计学意义(t=53.67，P< 0.05)。见图1。

图1 TACC2蛋白表达 a：癌旁正常组织；b：结直肠癌组织

2.2TACC2蛋白在不同结直肠癌细胞系中的表达

TACC2蛋白在LoVo细胞中的表达水平高于HCT116及SW480，差异有统计学意义(F=1022，P< 0.05)。见图2。因此我们选择LoVo细胞系用于后续研究。

图2 TACC2蛋白在不同细胞系中表达 A.LoVo细胞；B.HCT116细胞；C.SW480细胞

2.3PCR检测靶向抑制TACC2基因后的沉默效果TACC2 siRNA，siRNA-NC和blank转染到入LoVo细胞后TACC2基因△CT值分别为(4.09±0.02)、(2.39±0.03)、(2.41±0.03)，差异有统计学意义(F=11701，P< 0.05)。见图3。

图3 TACC2基因沉默效果 a. siRNA-NC；b. Blank；c. siRNA

2.4沉默TACC2基因对细胞增殖的影响将TACC2 siRNA、siRNA-NC和blank转染入LoVo细胞后，在24小时和48小时检测细胞增殖能力。见表1。

表1 LoVo细胞增殖能力

2.5沉默TACC2基因对p300蛋白表达的影响siRNA组与blank组对p300蛋白表达的影响差异无统计学意义(t=0.342，P> 0.05)。见图4。

图4 p300蛋白的表达 a. siRNA；b. blank

2.6沉默TACC2基因对p300-HAT活性的影响siRNA组p300-HAT活性为(0.00071±0.00004)，明显低于blank组(0.00167±0.00005)，差异有统计学意义(t=49.19，P< 0.05)。

2.7沉默TACC2基因对HIF-1α表达的影响与blank组相比，siRNA组HIF-1α蛋白表达量明显下降，差异有统计学意义(t=62.57，P< 0.05)。见图5。

图5 HIF-1α的表达 a： siRNA；b：blank

3 讨论

RNA干扰一般是通过siRNA来实现的，其可特异性的降解同源mRNA，并可抑制目的基因的表达[6]。本实验结果显示基于TACC2基因的siRNA能够有效抑制结直肠癌LoVo细胞中TACC2基因的表达，为下一步实验的开展奠定了基础。

TACC蛋白家族成员包括TACC1，TACC2和TACC3，这3个TACC蛋白基因组区域在某些肿瘤中存在重排，因此在不同的肿瘤组织中它们的表达水平可能不同[7～10]。如TACC3在肺癌细胞株中高表达，但是其在卵巢癌和甲状腺癌中的表达却明显降低[11，12]。在细胞有丝分裂期中TACC1在中心体上定位较弱，TACC2在中心体上定位较强，而TACC3在中心体及其附近都有较强的定位[13，14]。TACC1，TACC2和 TACC3定位的不同提示它们的功能可能存在差异。既往研究发现TACC2在乳腺癌和前列腺癌中明显高表达，并且TACC2表达水平与临床病理特征和患者预后密切相关。进一步研究发现外源性TACC2可明显促进乳腺癌细胞的增生，然而用siRNA沉默TACC2基因后则可明显抑制前列腺癌细胞增殖[4，5]。到目前为止TACC2基因与结直肠癌发生发展的关系并无相关报道。本研究结果发现TACC2基因在结直肠癌中的表达明显高于癌旁正常组织，说明TACC2参与结直肠癌的发生发展。进一步我们发现TACC2蛋白在LoVo细胞中的表达水平高于HCT116和SW480细胞中的表达，当用RNA干扰抑制TACC2基因的表达后LoVo细胞增殖能力明显下降，提示TACC2基因可能作为一种癌基因促进结直肠癌的发生。

为进一步研究TACC2基因调控结直肠癌细胞增殖的具体作用机制，我们从Pubmed Gene上搜索可与TACC2相互作用的基因，发现p300可与TACC2相互作用。人p300基因又称为p300蛋白，是一个重要的转录辅助活化因子，可为转录活化各组分如蛋白质之间或蛋白质和DNA之间的相互作用提供支架，并且p300可通过其具有的乙酰转移酶(HAT)活性调节核小体组蛋白，使染色质结构变得疏松从而促进转录，同时p300也可以直接乙酰化一些转录因子调控其活性，参与DNA修复、细胞增殖、分化及细胞凋亡等生物学过程[15，16]。p300作为p53、FOXO3 a和BRCA1的转录辅助活化因子，可发挥抑癌作用。然而在特定条件下p300作为c-Myc和AR的转录辅助活化因子也可促进肿瘤的发生，如p300可通过激活AR依赖性转录促进前列腺癌生长，当使用siRNA下调p300表达也可以抑制其增殖[17]。并且p300在肿瘤的化疗敏感性方面也有重要作用，其可介导阿霉素在膀胱癌中的化疗耐药[18]。本研究分析了TACC2和p300之间的相互作用，结果发现沉默TACC2后p300蛋白的表达并无明显变化，但是p300-HAT活性则明显降低，说明TACC2可能通过调控p300-HAT活性来发挥作用。

HIF-1α属于bHLH-PAS蛋白家族，是缺氧反应的关键转录因子，其主要功能是调节机体适应缺氧环境。缺氧是恶性肿瘤包括结直肠癌的重要微环境特点，既往研究发现HIF-1α在结直肠癌、肝癌、乳腺癌等多种恶性肿瘤中高表达[19]，并且作为转录因子HIF-1α可激活下游多种靶基因促进肿瘤血管的生成，肿瘤细胞的增殖及转移[20]。现有研究证实HIF-1α的C端反式激活域(C-terminal tmansactivation domain，CATD)可以与p300的CH1结构域结合，而CH1作为CATD结构域折叠的支架，可通过疏水极性相互作用使p300/HIF-1α复合物保持稳定[21]。p300/HIF-1α复合物可作为蛋白支架把不同转录因子连接到转录元件，同时p300具有的乙酰转移酶可通过调节组蛋白而改变染色质活性及结构，从而影响下游靶基因如血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)的表达来调控肿瘤细胞的增殖，因此以p300/HIF-1α复合物作为靶点的转录调节剂在抗肿瘤方面有很好的应用前景[22]。我们的研究发现沉默TACC2基因后HIF-1α的表达明显降低，目前尚无TACC2和HIF-1α直接作用的相关报道，我们分析其作用机制可能是因为沉默TACC2后p300-HAT活性降低，导致具有转录调控活性的p300/HIF-1α复合物表达下降，并进一步引起下游靶基因的表达抑制从而调控肿瘤细胞的增殖。

本实验通过RNA干扰抑制TACC2基因的表达后研究其对LoVo细胞增殖的影响极其作用机制，发现TACC2基因沉默后可抑制结直肠癌LoVo细胞增殖，其作用机制可能与下调TACC2/p300/HIF-1α信号通路有关。本实验证实了靶向TACC2/p300/HIF-1α信号通路的表达可为结直肠癌提供新的治疗策略，当然关于TACC2基因与p300的作用靶点，与下游基因的具体调控关系，及在动物实验中的效果还需要更加深入的研究。