安立生坦对低氧性肺动脉高压大鼠肺血管平滑肌细胞增殖与凋亡的影响

宋 强，胡 志，王 军，范粉灵，王宇星，张玉顺

(1.西安交通大学第一附属医院结构性心脏病科，陕西 西安 710061；2.陕西省人民医院，陕西 西安 710061)

低氧性肺动脉高压(hypoxic pulmonary hypertension，HPH) 是临床众多心肺疾病发展过程中的重要改变，以低氧性肺血管收缩(HPV) 和低氧性肺血管重建(HPSR) 为其主要的病理生理特征[1]。其中平滑肌细胞增殖引起的低氧性肺血管重建是药物治疗不佳的主要原因，如何减轻及逆转血管的重构成为治疗HPH 的关键[2]。安立生坦(ambrisentan)是一种高选择性内皮素受体拮抗剂，口服不仅能够降低肺动脉压力，而且对肝损害较小。为临床肺高压治疗药物中的新星[3]。有文献报道安立生坦在特发性肺动脉高压和硬皮病相关性PAH中治疗中的持续作用[4]，但关于HPH作用罕有报道。本研究通过建立HPH大鼠模型，给予安立生坦干预，观察其对肺动脉高压大鼠肺血管平滑肌增殖与凋亡的影响，进而探讨其治疗肺动脉高压的可能分子机制，并为临床上使用高选择性内皮素受体拮抗剂是否改善肺血管重塑提供理论基础。

1 材料与方法

1.1材料实验时间2016年4～8月，健康成年雄性SD大鼠40只，体重200～250 g，购于西安交通大学医学院实验动物中心。安立生坦(H20130365 Ambrisentan 凡瑞克)为葛兰素史克公司产品，兔抗大鼠Bcl-2，Caspase-3多克隆抗体和β-Actin抗体为美国Abcam公司产品，SP免疫组化试剂盒为北京中杉金桥生物技术有限公司产品，全自动调节低压低氧仓由第四军医大学生理实验室提供，RM-6200多道智能生理信号记录系统为成都仪器厂产品。

1.2模型建立在40只SD大鼠中随机选30只大鼠于低压低氧舱中饲养2周，8 h/d，再随机分为模型组、药物治疗组、安慰剂组各10只。HPH动物模型的建立采用李娟等[4]报道的方法。从第3周起，模型组继续在舱中饲养，药物治疗组大鼠每天进舱前给予凡瑞克5 mg/kg灌胃，安慰剂组大鼠于进舱前给予生理盐水2 ml灌胃；至第4周结束为实验终点，剩余10只作为对照组，正常环境中饲养4周。

1.3肺血流动力学测定实验满4周后，按Pei[5]等报道的方法，自大鼠右颈外静脉插入聚乙烯塑料管，导管另一端与微型压力传感器相连，导管进入肺动脉干。采集、记录及分析指标大鼠平均肺动脉压力(mPAP)，计算右心肥厚指数RV/(LV+S)。

1.4肺小动脉形态学分析在400倍光镜下观察并拍片，每张切片连续观察肺组织中型肺动脉或小型肺动脉，应用Nikon &Spot 图像分析系统进行检测：RMT为T(肺理想血管中膜厚度)与R(外弹力层包绕的理想血管半径)之比，T为R与r(内弹力层包绕的理想血管半径)之差。每只大鼠测5～10个，求其均值。

1.5肺动脉Bcl-2免疫组织化学染色法将肺组织石蜡切片常规脱蜡，孵育、修复抗原、恒温箱中封闭1 h后，依次滴加一抗即Bcl-2多克隆抗体(1：200)，Caspase-3多克隆抗体(1：300)、生物素化的羊抗兔IgG及辣根过氧化物酶标记的链霉卵白素，最后经显色及复染。采用Motic医学图像采集和分析系统，对Bcl-2和 Caspase-3的定位及表达进行分析，放大倍数×400，随机选取5个视野，利用图像分析系统测得平均灰度。

1.6Bcl-2、Caspase-3蛋白表达定量测定常规提取总蛋白，进行SDS-PAGE凝胶电泳，转膜，封闭60 min。加入一抗(Bcl-2：1：500；Caspase-3：1：800)，β-αctin：1：8000)，4℃过夜。加入酶标记二抗(1：8000)，37℃孵育1小时。发光剂曝光并拍照记录。以Quantity One成像分析系统进行WB条带的灰度值分析。

1.7统计学方法采用SPSS 18.0统计软件进行数据分析。计量数据均采用均数±标准差表示，数据先进行正态性检验，符合组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析，不符合进行对数转换。P< 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1HAEPH模型的确认大鼠血流动力学、右心室肥厚的指标模型组mPAP、RVSP明显高于对照组，差异均有统计学意义(P<0.05)；药物治疗组mPAP、RVSP较模型组、安慰剂组显著降低，差异均有统计学意义(P<0.05)，药物治疗组与对照组相比较，差异无统计学意义(P> 0.05)。见表1。

表1 各组大鼠对HPH大鼠血流动力学的影响的比较(n=10)

a与对照组比较，P< 0.05；b与模型组比较，P< 0.05；c与安慰剂组比较，P< 0.05

2.2肺动脉形态学指标的变化对照组大鼠动脉内膜完整光滑、管壁薄、管腔大、肌层无增厚(图 1)；模型组与安慰剂组大鼠出现肺动脉中层增厚、细动脉肌型化、血管内膜细胞增殖及管腔变窄等肺血管重构的变化。而药物治疗组大鼠肺动脉的管壁厚度、管腔大小恢复至对照组的状态，表明肺动脉重构得到抑制及逆转。与模型组和安慰剂组比较，药物治疗组HPH大鼠管壁面积占血管总面积的百分比(WA%)、肺血管管壁厚度占外径的百分比(WT%)均显著降低(P< 0.05)；与对照组比较，模型组和安慰剂组HPH大鼠WA%、WT%均显著增高(P< 0.05)，药物治疗组差异无统计学意义(P> 0.05)，见表2。

图1 各组大鼠肺小动脉形态学变化的观察 (HE染色，×400) A：模型组；B：药物治疗组；C：安慰剂组；D对照组

表2 各组大鼠WA%和WT%的比较(n=10)

a与对照组比较，P< 0.05；b与模型组比较，P< 0.05；c与安慰剂组比较，P< 0.05

2.3大鼠肺动脉Bcl-2蛋白的表达与对照组相比，模型组大鼠肺组织Bcl-2蛋白的表达显著增加(P< 0.05)；与模型组相比，药物治疗组 Bcl-2的表达量减少(P< 0.05)；药物治疗组肺动脉平滑肌Bcl-2与对照组差异无统计学意义(P>0.05)，见图2，图3，表3。

图2 各组大鼠肺组织中Bcl-2蛋白分布和表达的免疫组化染色检测(免疫组化染色，×400) A：模型组；B：药物治疗组；C：安慰剂组；D：对照组

图3 各组大鼠肺组织中Bcl-2蛋白的相对表达量的比较 A：模型组；B：药物治疗组；C：安慰剂组；D：对照组。与对照组比较，aP < 0.05；与模型组比较，bP < 0.05；与安慰剂组比较，cP < 0.05

表3 各组大鼠肺组织Bcl-2蛋白表达(n=10)

与对照组比较，aP< 0.05；与模型组比较，bP< 0.05；与安慰剂组比较，cP< 0.05。

2.4大鼠肺动脉中Caspase-3蛋白表达免疫组化染色法及Western Blot结果均显示与对照组相比，模型组肺动脉平滑肌中Caspase-3的表达明显降低(P< 0.05)；与模型组相比，药物治疗组肺动脉平滑肌Caspase-3的表达显著升高(P< 0.05)；药物治疗组肺动脉平滑肌Caspase-3与对照组表达差异无统计学意义(P>0.05)。见图4，图5，表4。

图4 各组大鼠肺组织中Caspase-3蛋白分布和表达的免疫组化染色检测(免疫组化染色，×400) a：模型组；b：药物治疗组；c：安慰剂组；d： 对照组

图5 各组大鼠肺组织中Caspase-3蛋白的相对表达量的比较 A：模型组；B：药物治疗组；C：安慰剂组；D：对照组。与对照组比较，aP < 0.05；与模型组比较，bP < 0.05；与安慰剂组比较，cP < 0.05

表4 各组大鼠肺组织Caspase-3的表达(n=10)

与对照组比较，aP< 0.05；与模型组比较，cP< 0.05；与安慰剂组比较，eP< 0.05

3 讨论

HPH是高原地区中的一种常见病、多发病，是以肺动脉压力升高、低氧血症为主要特征，其中肺血管重塑是HPH发生、发展的关键环节。长期低氧条件时，肺动脉平滑肌细胞生长调控失衡，引发细胞的异常增殖、迁移以及细胞外基质的过度沉积，最终促进肺血管重塑的发生[6]。

在本实验当中，模型组与安慰剂组SD大鼠的mPAP、RVSP、dP/dtmax及RV/(LV+S)均明显高于对照组，提示HPH大鼠模型的构建成功。而药物治疗组大鼠的上述指标均明显低于模型组和安慰剂组大鼠，表明凡瑞克作为ETAR的拮抗剂，能有效地降低HPH大鼠模型肺动脉压力。肺血管HE染色结果显示，与对照组相比，模型组与安慰剂组大鼠的肺血管的中层增厚，细动脉肌型化，肺血管内膜细胞增殖，血管腔明显狭窄，WT%、WA%明显增高；而药物治疗组的大鼠上述指标显著改善，提示凡瑞克可有效逆转HPH中肺血管重塑的作用。

细胞凋亡与细胞增殖的相互作用是影响血管组织重塑的重要因素。正常情况下二者处于相对动态平衡以维持组织的正常形态。当机体处在缺氧、毒素等情况下上述平衡被打破，细胞增殖的数量超过细胞凋亡的数量时就可能出现组织重塑。细胞的凋亡是受基因控制的，Bcl-2作为调控细胞凋亡的重要基因，其蛋白质产物能够抑制细胞的凋亡。Caspase-3是导致细胞凋亡的最强大、最终效应因子，Caspase-3是细胞凋亡过程中最重要的终末剪切酶[7，8]。Bcl-2通过抑制细胞线粒体PT通道的开放(即线粒体膜电位下降)，从而阻止线粒体细胞色素C的释放进而抑制Caspase-3的激活，最终达到阻止细胞凋亡的发生，于此同时Bcl-2亦能直接抑制线粒体细胞色素C的释放从而减少Caspase-3的激活[9～11]。在该实验中，与对照组相比，模型组Bcl-2的蛋白表达显著增高，而Caspase-3的蛋白表达显著降低，提示Bcl-2及Caspase-3的表达失衡共同参与了HPH的发生及发展。与模型组相比，药物治疗组Bcl-2蛋白表达降低，Caspase-3蛋白表达升高，肺血管厚度及管腔大小得到显著改善，肺血管重塑减轻。以上实验结果提示凡瑞克抑制肺血管平滑肌增殖、促进其凋亡可能与通过下调Bcl-2蛋白表达有关，从而改变Bcl-2/bax的比例，增加细胞对凋亡信号的易感性，最终肺血管平滑肌细胞发生凋亡[12～14]。据此，我们推测凡瑞克对HPH动物模型肺血管重塑的抑制作用，可能通过抑制Bcl-2，直接和间接两个方面激活Caspase-3蛋白，诱导肺动脉平滑肌细胞凋亡[15～19]。

综上，凡瑞克可能是通过抑制低氧SD大鼠肺动脉中Bcl-2的合成、促进Caspase-3的生成，激活凋亡通路，逆转肺血管的重塑，进而达到治疗肺动脉高压的作用。然而，仍需更多研究进一步明确凡瑞克在治疗肺动脉高压中的相关分子机制。