蝴蝶兰品种数量性状与分组性状的DUS判定

张 鹏，王江民，管俊娇，刘艳芳，杨晓洪，马芙荣，张建华

(云南省农业科学院 质量标准与检测技术研究所，云南 昆明 650205)

蝴蝶兰(PhalaenopsisaphroditeRchb. F.)为兰科(Orchidaceae)蝴蝶兰属(Phalaenopsis)植物，有70多个原生种，主要分布于印度洋及南洋岛屿，中国台湾地区也有分布[1]。蝴蝶兰现栽培普遍，是极具经济价值的观赏花卉品种，在市场上占有重要份额。随着各地区间品种的流通，杂交新品种大量上市，蝴蝶兰资源数量越来越巨大。近些年来，针对蝴蝶兰的研究多集中于组培扩繁、生长调节剂与花期调控及观赏性状评价等方面[2-3]，而对于SSR标记开发、花及子房的发育[4]、花色基因及香味基因的研究尚少有报道[5-6]。花卉品种的观赏性状是品种特性的重要组成部分，也是衡量品种优劣的主要标准，基于蝴蝶兰表型形态遗传多样性及品质性状研究较少的现状，系统开展其遗传多样性特点的发掘、利用和评价等研究，将会拓宽优良性状遗传选育范围，对新品种育种、资源保护等具有重要意义[7-8]。

DUS为品种特异性(Distinctness)、一致性(Uniformity)和稳定性(Stability)的简称。任何一个植物新品种要获得保护的前提是必须能被明确定义[9]，DUS测试已逐步成为定义品种的科学方法，是目前我国作物品种管理、新品种保护、育种评价和优良种子评价的重要技术[10-12]。数量性状作为植物形态描述的主要指标体系，在DUS测试中具有重要位置[13-14]。DUS测试多以形态学测量为主，但也有部分作物品种利用分子标记等方法进行品种鉴定[15-16]。数量性状是DUS测试的一类重要性状，主要通过直接测量得到，由于数量性状易受栽培年份、栽植地点、种植时间、栽培环境和栽培措施等影响[17]，存在测量指标可重复性和数据通用性较差、DUS判定难于把握等技术问题，常通过种植标准品种作为参照[18]，也可以通过多年测试对分级标准进行校正[19]。分组性状主要用于品种分组，利用分组性状可以避免在DUS测试中将性状差异较大的近似品种与申请品种相邻种植，对于品种类群划分和近似品种筛选有重要意义[20]。

蝴蝶兰DUS测试指南已于2012年发布[1]，但其中并未明确如何确定数量性状分级和分组性状，只概述了数量性状及标准品种等的确定，因此在实际应用中还存在一些不足。本研究通过收集蝴蝶兰资源，对48个蝴蝶兰品种的植株大小、叶片长度、叶片宽度、花序长度、花朵数量、花序梗长度、花序梗粗度、花长度、花宽度、萼片长度、萼片宽度、花瓣长度、花瓣宽度、唇瓣中裂片长度、唇瓣中裂片宽度等15个数量性状进行测试，利用SPSS 20.0进行数理统计与分析，以期为蝴蝶兰品种数量性状表达的DUS判定与分组性状的选择提供科学理论依据，并通过比较对现有DUS测试指南提出修订建议，以加强蝴蝶兰品种保护，提高品种育种水平，树立测试标准的权威性。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 试验品种 收集来自全国各地的48个蝴蝶兰新品种，其中浙江品种33个，福建品种13个，云南品种2个。参试品种及其来源见表1。

1.1.2 试验设施及条件 阳光板玻璃温室320 m2，加湿设施9套，空调9个。利用温室设施设备，昼温控制在25～28 ℃，夜温控制在18～20 ℃，湿度控制在60%～70%，采取遮阴网遮阴，保证蝴蝶兰正常生长。

1.1.3 基 质 由于蝴蝶兰是肉质根，用泥土种植根系易腐烂，需使用具有良好吸水排水性、通气好、耐腐烂的基质。本试验采用的基质由泥炭藓、水苔、碎树皮和少量腐叶土混合而成。使用不同高度和口径的塑料花盆种植，规格分别为12 cm×10 cm、16 cm×14 cm和20 cm×18 cm。

表1 参试48个蝴蝶兰品种及其来源Table 1 The origins of 48 Phalaenopsis varieties

1.2 试验方法

1.2.1 试验设计 按照《植物新品种DUS测试指南——蝴蝶兰》(YN/T 2230-2012)[21]规定的方法，每个品种分2个重复相邻种植，每个重复15株，定期观测病虫害并及时处理，保证植株的正常生长[1]。

1.2.2 数据采集 每个品种30株，无病虫，于2014年1月至2016年12月在嵩明基地统一栽培管理，株龄达18个月后开始观测[21]。按照《植物新品种DUS测试指南——蝴蝶兰》(YN/T 2230-2012)[21]规定的方法，对48个蝴蝶兰品种的植株大小、叶片长度、叶片宽度、花序长度、花朵数量、花序梗长度、花序梗粗度、花长度、花宽度、萼片长度、萼片宽度、花瓣长度、花瓣宽度、唇瓣中裂片长度、唇瓣中裂片宽度等15个数量性状进行测量。植株的测量在植株开花时观测叶片的最大开展度；叶片的观测在开花植株的最长叶上进行；萼片、花瓣和唇瓣的测量应为相应部位的最大长或宽；花性状的观测在花序上有50%的花开放时进行，选择最近开花的最大花并在其花色未褪去之前进行观测；花长度和花宽度及花其余各部位测量在花保持自然的状态下进行。

1.3 DUS测试数量性状的表达状态划分

数量性状的表达状态通常是根据采集的数据计算出均值，将此平均值设定为代码5范围的中位数，依照极差大于2倍LSD0.05(最小显著差数)的原则，分别向两端极值区间进行划分，每个分级包含的区间均不小于2倍LSD0.05，之后得到9个区间，每个区间就用代码1～9表示，而其中代码1和代码9不设最小值和最大值[19]。

1.4 数据分析方法

对所采集的15个数量性状数据，用Excel计算变异系数和多样性指数，变异系数(CV)计算公式为CV=(标准差/平均值)×100%，其中标准差和平均值根据各性状采集数据计算得到；Shannon-Wiener多样性指数(以下简称多样性指数)的计算公式为H=-∑Pi×lnPi，式中Pi=Ni/N，Pi表示代码分级在i级的样本数据的相对多度，Ni为代码分级在i级的数据总数，N为各数量性状采集到的数据总数。多样性指数数值大小的意义在于：调查样本中，每一个品种的数据所在分级越均匀，多样性指数值就越大。如果在某一个性状调查样本中，每一个品种的数据都处于不同的分级，说明多样性指数就最大；而在某一个性状调查样本中，每一个品种的数据都在同一分级，则其多样性指数就最小。

利用SPSS 20.0进行主成分分析与计算。主成分分析是数据统计分析的常用方法之一，其利用成分矩阵做出的二维载荷图，可以直观反映原始变量之间的空间关系。二维载荷图中，横、纵坐标表示对应的主成分值，距离横纵坐标越近的点，表示越能被该坐标表示的主成分解释，即该主成分的重要程度相对越大，二维载荷图中多点形成一个集群，该集群可以用标准化后的某一个主成分来表示，以代替原有的多个成分，减少数据过多或重叠带来的不便[22]。因此，在本研究中利用主成分分析方法作为确定分组性状的科学方法，在15个蝴蝶兰数量性状中筛选出分组性状。

2 结果与分析

2.1 蝴蝶兰品种DUS测试数量性状表达状态的划分

根据数量性状表达状态的划分方法，将所测蝴蝶兰品种的15个数量性状均划分为9级表达状态，经过统计与分析得到的蝴蝶兰15个数量性状的均值、LSD0.05见表2，然后据此进行各代码分级区间划分，限于篇幅，划分的区间未具体列出。

表2 蝴蝶兰15个数量性状的等级划分Table 2 Level partition of Phalaenopsis quantitative characters

2.2 蝴蝶兰15个数量性状的稳定性分析

从表3可以看出，蝴蝶兰15个数量性状的变异幅度为0.41～46.5 cm(朵)，其中植株大小的变异范围最大，花序梗粗度的变异范围最小；15个数量性状的变异系数为14.66%～44.59%，其中唇瓣中裂片长度的变异系数最小，花朵数量的变异系数最大。具体来看，花序长度的变异幅度为41 cm，仅次于植株大小性状，且其变异系数也较大，说明蝴蝶兰品种在该性状上变化较大；唇瓣中裂片长度变异幅度为2.1 cm，仅次于花序梗粗度，变异系数在各性状中最小，说明蝴蝶兰品种在该性状上变化很小。变异系数是衡量观测值变异程度的一个统计量，其值越大表明变异程度越大，一定程度上可以反映性状是否稳定，从之前数据分析来看，15个数量性状中唇瓣中裂片长度的变异系数最小，那么该性状相对稳定，花朵数量的变异系数最大，表明该性状相对变异程度大，性状稳定性低。

表3 蝴蝶兰数量性状的变异程度及多样性指数分析Table 3 Analysis of variation degree and diversity indexs of the quantitative characters of Phalaenopsis

从表3的多样性指数来看，15个数量性状的多样性指数为1.882 3～2.099 8，其中以叶片宽度的多样性指数值最大，花瓣宽度的多样性指数值最小，客观反映了性状遗传的多样性。另外，叶片长度、叶片宽度、花序长度、花序梗长度、花序梗粗度、花长度等性状的多样性指数值相对较大，说明这些性状的表达状态较为丰富，采集到的样本数据在各级间的分布相对均匀；而花朵数量、萼片宽度、花瓣宽度、唇瓣中裂片长度等性状的多样性指数值相对较小，说明这些性状的表达状态相对较少。

比较各类数量性状变异系数的平均值，可知蝴蝶兰叶片、花序、萼片、花瓣和唇瓣几个部位性状变异的大小表现为：花序性状(31.83%)>花瓣性状(25.72%)>萼片性状(23.40%)>叶片性状(20.26%)>唇瓣性状(18.96%)。可见作为观赏性较强的花卉品种，蝴蝶兰花朵的性状，尤其是花序长度与花朵数量都有很大的选择空间。花朵性状是花卉最主要的观赏部位，其数量性状的变异幅度越大则对新品种的选育空间有较大程度的提升，因此在选育优良蝴蝶兰单株品种时应优先考虑花朵性状[23-24]。

2.3 蝴蝶兰DUS测试分组性状的判定

在DUS测试中，分组性状是一类重要性状。分组性状的表达状态，即使来自不同地域，仍可以单独或与其他该类性状的表达状态结合使用，分组性状应是质量性状，或是能够有效区分品种的数量性状或假质量性状[25-26]。蝴蝶兰DUS测试性状较多，如何确定实用性强的分组性状对于品种划分意义重大，但目前关于分组性状如何确定尚缺乏科学方法，本研究利用主成分分析法确定蝴蝶兰品种DUS测试数量性状的分组性状。

表4为蝴蝶兰数量性状DUS测试数据主成分分析总方差解释表。由于主成分的贡献率是以主成分反映原变量方差的多少来衡量，根据主成分分析法，以特征值累积贡献率大于80%作为提取主成分的标准。通过分析蝴蝶兰数量性状DUS测试数据后，选取前3个成分(累积贡献率达到83.636%)作为主成分，其中主成分1，2，3的贡献率分别为61.915%，13.682%和8.039%。

根据表4结果，选主成分1，2，3进行降维，然后以这3个因子替代原有的15个数量性状因子，则每个主成分就是1个综合指标。结合表5各个性状对主成分1，2，3的分析结果，可知在这3个主成分因子中，花宽度对主成分1的影响最大，花朵数量影响最小；叶片长度对主成分2影响最大，唇瓣中裂片长度的影响最小；花朵数量对主成分3影响最大，植株大小影响最小。

表4 蝴蝶兰DUS测试数据总方差解释表Table 4 Total variance explained of Phalaenopsis DUS testing data

表5 蝴蝶兰15个数量性状的成分矩阵Table 5 15 Quantitative character component matrix of Phalaenopsis

图1-a、b、c为蝴蝶兰15个数量性状DUS测试数据主成分1与主成分2、主成分1与主成分3和主成分2与主成分3的二维载荷图。由图1-a可见，与花朵有关的性状相对比较集中，都处于一个集群，且距离横坐标较近，而叶片长度、宽度性状与植株大小为另一个集群，花朵数量又单独为一个集群。

由图1-b可见，相对于图1-a而言，各性状集群不明显，相对较为分散，但仍然可以分为3个主要集群，即与花朵性状因子集群、叶片性状因子和植株大小集群以及花朵数量集群。

由图1-c可以看出，15个数量性状同样可以分为花朵性状因子集群及叶片性状和植株大小集群等，但花朵数量与花序长度却处于同一个集群；花序梗粗度与之前分析结果略有不同，而与植株、叶片性状相对较为集中。

A.植株大小；B.叶片长度；C.叶片宽度；D.花序长度；E.花朵数量；F.花序梗长度；G.花序梗粗度；H.花长度；I.花宽度；J.萼片长度；K.萼片宽度；L.花瓣长度；M.花瓣宽度；N.唇瓣中裂片长度；O.唇瓣中裂片宽度A.Plant length;B.Leaf length;C.Leaf width;D.Inflorescence length;E.Flower number;F.Peduncle length; G.Peduncle width;H.Flowers length;I.Flowers width;J.Dorsal sepal length;K.Dorsal sepal width;L.Petal length; M.Petal width;N.Apical lobe length;O.Apical lobe width图1 蝴蝶兰DUS测试数据主成分1、主成分2和主成分3的二维载荷图Fig.1 Two-dimensional loading graph of principal component 1,principal component 2 and principal component 3 of Phalaenopsis DUS testing data

综合图1-a、b、c可以发现，总体来看，花朵性状集群、叶片性状和植株大小集群及花朵数量集群都可以区分，但因花序因子情况特殊，除了花朵数量这一因子能明显与其他2个集群划分开而始终为一个集群外，花序长度、花序梗长度和花序梗粗度的分布存在变化，而且与其他因子的相对距离也并不相同。在图1-a、b、c 3个载荷图中，根据各自划分的3个集群，以及表5中占集群主成分比重最大的性状分布，最终选择出3个分组性状，分别是花宽度、叶片长度和花朵数量。

3 讨 论

关于蝴蝶兰品种数量性状的代码分级，本研究均按9级代码划分，与已有的《植物新品种DUS测试指南——蝴蝶兰》(YN/T 2230-2012)中的划分一致，但未查阅到现有蝴蝶兰标准具体的等级划分范围和级差，无法进行比较。基于多年的测试经验，认为数量性状代码分级因为栽培条件、年份、品种内变异、气候环境变化等原因存在不确定性，虽然本研究以及现行蝴蝶兰测试指南确定了蝴蝶兰15个数量性状均按9级代码划分，但以某一个固定的数量分级作为性状等级的划分标准并不妥当，尤其对于本研究中变异系数较大、稳定性低的花朵数量这类性状，应当将大量的年度间的数据进行集中分析，同时选择稳定且具有典型性状特征的标准品种作为参照[27]，对年度间的数据进行校对和修订，从而确保品种测试的客观性与合理性。此外，使用某个测试指南对相应种属进行多年测试后，可以考虑对现行指南进行适当修订，以增强指南的实用性和科学性。

本研究中，所确定的3个分组性状，即花宽度、叶片长度、花朵数量与《植物新品种DUS测试指南——蝴蝶兰》中的分组性状(数量性状)，即植株大小、花宽度并不完全一致，原因可能是植株大小观测的是叶片的最大开展度，因此植株大小与叶片长度密切相关，叶片长度大的植株整体开展度也相对较大，因此二者具有一定的相关性；花宽度和花朵数量作为花朵部位的主要性状，花朵的多少及大小与花应具有密切的相关关系，是蝴蝶兰观赏价值的综合反映，但在《植物新品种DUS测试指南——蝴蝶兰》中并未列出花朵数量性状。因此，也可以考虑将其作为一个分组性状在现行指南修订中加以补充。

值得注意的是，本研究仍存在一些不足，如品种类型少、缺乏数据的年度间校对、未能开展更为深入的数据挖掘等，这些不足将随着今后测试工作的深入开展及新方法、新工具的开发，逐渐积累并得到完善。