microRNA363在缺血性脑损伤中的表达及头电针调控作用研究*

2018-12-06张立峰孙先越张晓丹程玉宏李仕奎王丽丽李凌雁

针灸临床杂志 2018年11期

张立峰,孙先越,张晓丹,程玉宏,李仕奎,王丽丽,李凌雁

(1.大庆医学高等专科学校，黑龙江大庆 163312; 2.大庆油田总医院，黑龙江大庆 163312)

脑血管病是危害人类健康的常见病，具有高发病率、高死亡率和高致残率的特点，目前是世界第三大死因[1]。有研究表明[2]，在急性缺血性脑损伤中半胱氨酸天冬酶(Caspase)扮演着重要角色，半胱氨酸天冬酶是凋亡程序启动和执行过程中的一类蛋白酶家族，参与神经凋亡的早期启动，Caspase-3是其中最具代表性的蛋白，是细胞凋亡蛋白酶级联反应的必经之路，也是多种凋亡途径共同的下游效应部分。近年发现[3]Caspase-3表达与一部分微小RNA(microRNA，miRNA) 密切相关。新近研究表明[4]，上调microRNA363在人脑胶质瘤中可增加细胞存活和增殖，说明microRNA363可能具有潜在的神经保护作用。但对缺血性脑损伤的作用及与Caspase-3的相关性目前尚无报道。猜测Caspase-3可能受microRNA363的调控，进而抑制神经元的凋亡。本研究在前期工作基础上，拟从microRNA水平与神经细胞凋亡间的关系及头电针对其影响作用进行研究，一方面探索microRNA363在急性脑缺血损伤中是否具有神经保护作用，能否作为早期诊断缺血性脑血管病的生物标记物，另一方面探讨头电针能否通过调控microRNA363表达，进而影响Caspase-3水平，以达到抑制神经细胞凋亡的目的。

1 材料与方法

1.1 脑缺血模型建立

选用清洁级Sprague-Dawley(SD)雄性大鼠100只,体质量(250±30)g，随机选取其中80只，采用10%水合氯醛0.4～0.5 mL/kg体重腹腔注射，麻醉大鼠。用改良的Longa线栓法[5]建立永久性大脑中动脉阻塞脑缺血模型，均阻断左侧大脑中动脉24 h。另20只不阻断动脉，作为假手术组。

1.2 实验分组

参照Longa[5]5分制评分标准进行评分。得分在1～4分的为手术成功。将造模成功大鼠随机分为4组：①模型组：造模成功后，不进行头针治疗，正常饮食；②非穴区组：在头针穴区向后平移0.5 cm，与穴区平行的部位进行针刺；③头针组：头针治疗；④头电针组：头电针治疗。假手术组：不阻断左侧大脑中动脉，肢体功能正常，正常饮食，不进行针刺治疗。

1.3 头针及头电针治疗

造模48 h后给予头电针方法，按照“大鼠穴位图谱”所示，使用华佗牌针灸针(0.25 mm×25 mm)在大鼠右侧取顶颞前斜线(前神聪→悬厘)进针，上下各一针，平刺，深度为15 mm。针后连接电针治疗仪，选取100 Hz/2 Hz疏密波，强度为1 mA，刺激时间为30 min，每日1次。

1.4 治疗时间

非穴区组、头针组及头电针组分别治疗7天。

1.5 检测指标

1.5.1 局灶性缺血大鼠神经功能评定参照Longa[5]5分制评分标准进行评分。

1.5.2 脑梗死体积各组动物在脑缺血后处死，断头取脑，-20℃冷冻10 min后，切成厚度为2 mm脑片，在37℃的2%TTC溶液中染色30 min。染色之后浸入4%中性多聚甲醛溶液中保存，拍照、用图象分析系统扫描缺血面积，再换算成体积，计算相应脑组织总面积，据此计算各组动物脑组织的梗死率。

1.5.3 Caspase-3蛋白表达 Western blot技术检测。取相应处脑组织，分别做HE染色，检测Caspase-3蛋白表达水平。

1.5.4 microRNA363 实时荧光定量PCR技术检测。取脑皮质区组织标本。使用miRNeasy Mini试剂盒提取总RNA。TaKaRa逆转录试剂盒将RNA转录成cDNA。将获取的DNA稀10倍后进行Real-Time PCR反应。采用2-△△CT法统计microRNA363表达。

1.6 统计学分析

2 实验结果

2.1 各组神经功能评分比较

大鼠神经功能Longa评分显示，非穴区组、头针组及头电针组干预后较模型组均有显著变化(P<0.05)，说明头针对急性缺血性脑损伤大鼠神经功能具有较好效果；组间比较，头针组与非穴区组干预后没有显著性差别(P>0.05)，头电针组Longa评分明显降低(2.45±0.69)，与头针组及非穴区组比较均具有显著性差异(P<0.05。见表1。

2.2 各组脑梗死体积比较

非穴区组、头针组及头电针组的脑梗死体积干预后均较模型组有明显变化(P<0.05)，但头针组(28.97±5.11)与非穴区组(29.16±4.65)比较，无明显差异(P>0.05)；干预后，头电针组脑梗死体积明显减小(21.66±4.59)，较非穴区组和头针组均有显著性差异(P<0.05)。见表1。

2.3 各组Caspase-3蛋白表达比较

假手术组有少量的Caspase-3蛋白表达，与假手术比较模型组蛋白水平增加(1.819±0.033)，明显上调Caspase-3蛋白表达(P<0.05)，说明脑损伤后Caspase-3蛋白表达显著提高；非穴区组、头针组及头电针组与模型组分别进行比较，干预后Caspase-3均有明显下降(P<0.05)，说明头针对急性缺血性脑损伤均具有明显抗细胞凋亡作用；干预后，头电针组Caspase-3蛋白表达明显下调(1.310±0.040)，与非穴区组和头针组比较均具有显著性差异(P<0.05)，但非穴区组与头针组之间比较，无显著性差异(P>0.05)。见表2。

表1 各组Longa评分与脑梗死体积比较

注：与模型组比较,★P<0.05；与非穴区组比较,■P>0.05,△P<0.05；与头针组比较,○P<0.05

表2 各组Caspase-3与microRNA363表达水平比较

注：与模型组比较,★P<0.05；与非穴区组比较,■P>0.05,△P<0.05；与头针组比较,○P<0.05

2.4 各组microRNA363表达比较

模型组有少量的microRNA363表达(2.51±0.59)，与假手术组比较明显下降(3.34±0.33)，说明脑损伤后microRNA363表达显著下调；非穴区组、头针组及头电针组与模型组分别进行比较，干预后均有明显增加(P<0.05)，说明头针对急性缺血性脑损伤均可显著提高microRNA363表达；干预后，头电针组microRNA363表达明显上调(9.98±0.87)，与非穴区组和头针组比较均具有显著性差异(P<0.05)，但非穴区组与头针组之间比较，无显著性差异(P>0.05)。见表2。

2.5 microRNA363表达与Caspase-3相关性分析

实验结果显示，急性脑缺血大鼠microRNA363明显降低，Caspase-3表达明显提高，行相关分析，发现两者呈负相关(r=-0.930，P<0.01)，说明在急性脑损伤中microRNA363呈低表达水平，过表达可能通过调控Caspase-3抑制神经细胞凋亡。见图1。

图1 microRNA363表达与Caspase-3相关性

3 讨论

早期研究表明[6]，少数非编码RNA ( non-coding RNA，ncRNA)可能作为遗传信息传递的中间产物来协助蛋白质的翻译和RNA转录，但大部分ncRNA是没有功能的，因此它并没有引起足够重视。然而近年研究显示[7]，这类基因组的“暗物质”不但在细胞分化、增殖和衰老过程中发挥重要作用，而且还可能参与了神经退行性疾病和心血管疾病等疾病的病理进程。微小RNA(microRNA，miRNA)是一类小分子非编码RNA，大约由20～22个碱基组成。有研究表明[8]，miRNAs通过调控其靶mRNA 翻译过程发挥基因表达的调控作用，从而广泛参与了细胞的增殖、分化以及凋亡等多种生物过程，目前在脑损伤机制研究中，miRNA是分子机制研究的热点之一。新近研究表明[4]，上调microRNA363在人脑胶质瘤中可增加细胞存活率和增殖率。

为探究microRNA363在缺血性脑损伤中表达及对Caspase-3影响，本实验在缺血脑组织中进行荧光定量PCR实验，发现有明显下降，同时发现Caspase-3水平有明显上升，进而进行相关分析显示，microRNA363与Caspase-3表达呈现负相关性，说明在急性脑损伤中， microRNA363具有神经保护作用，其机理可能是通过调控Caspase-3从而抑制神经细胞的凋亡。microRNA363可能作为早期诊断缺血性脑血管病的生物标记物。

实验第二部分是比较不同头针方法治疗的差异性。结果显示经头针治疗后，非穴区组、头针组及头电针组在Longa评分、脑梗死体积、Caspase-3表达及microRNA363均明显优于模型组，证实了头针对急性缺血性脑损伤治疗的有效性[9]，但非穴区组与头针组比较没有明显差别，可能与以下因素有关：①头针组选用穴区为右侧取顶颞前斜线(前神聪→悬厘)进针，此区域为大脑皮层中央前回在头皮表面上的投影，非穴区组选取的穴区为顶颞前斜线向后平移0.5 cm处，两者距离较近，脑损伤时，周围神经组织进行代偿，故在神经功能恢复等方面，两者无显著性差异；②可能与针刺治疗时间有关，治疗时间为7天，可能尚未显示出差异性。然而，头电针组在上述指标中，均明显优于非穴区组和头针组。笔者分析首先本研究选取顶颞前斜线穴区是大脑皮层中央前回在头皮表面上的投影，直接刺激能增强减退的大脑神经元的能量代谢，有效促进大脑侧支循环的建立，从而减少皮层神经细胞的死亡；其次，有文献显示[10-11]2 Hz电刺激信号通过下丘脑弓状核、中脑导水管周围灰质、延脑到达脊髓背角神经元，抑制其对伤害信号的传递；100 Hz电频率激活一条较短的传导通路，经臂旁核、中脑导水管周围灰质、延脑到达脊髓背角神经元。大量实验显示100 Hz电针和2 Hz电针是两种性质不同的治疗方法[12]。本实验笔者选取100 Hz/2 Hz疏密波进行电刺激，两种波形共同作用，一方面起到不同的治疗效果，另一方面还可有效缓解患者的疲劳程度，避免出现治疗的耐受性。