合浦珠母贝幼虫培育的饵料优化研究

邓正华, 陈明强, 王 雨, 黄桂菊, 于 刚，吴开畅, 李有宁

( 中国水产科学研究院 南海水产研究所，农业农村部南海渔业资源开发利用重点实验室，广东 广州 510300 )

合浦珠母贝(Pinctadafucata)又称马氏珠母贝(P.martensii)，是培育海水珍珠的主要暖水性海洋双壳贝类，主要分布于中国、日本、印度、澳大利亚和东南亚等热带和亚热带的沿海国家，在中国分布于广东、广西和海南等沿海[1-2]。闻名遐迩的“南珠”就是以合浦珠母贝培育的珍珠，该珍珠养殖产业为部分沿海地区支柱产业之一[3]，已形成一条完整的产业链。国内外对合浦珠母贝的研究主要集中在遗传育种[4]、苗种繁育[5]、摄食生理[6]、免疫学[7]及分子生物学[8-11]等方面。虽自1965年就已成功开展了合浦珠母贝的人工繁育研究[4]，但幼虫培育的死亡率较高，苗种培育效果极不稳定。目前，合浦珠母贝的苗种供应仍依赖亲贝的大繁殖量，提高人工育苗的幼虫成活率势在必行。在其他海洋双壳贝类幼虫培育中，通过分析单胞藻营养价值和幼虫营养需求[12-16]，调控单胞藻投喂量和投喂频率[17-18]，以及寻找其他替代饵料[19]可提高幼虫生长速率和成活率。但是，并非所有的单胞藻都能被幼虫摄食和消化[20-21]，充分了解投喂饵料的消化、吸收率是饵料选择的基础。单胞藻胞径、消化难易及生化组成等直接影响其能否作为幼虫培育的饵料，尤其是消化性直接影响幼虫的生长和成活率。Martínez-Fernández等[20]用10种单胞藻投喂企鹅珍珠贝(Pteriasterna)幼虫，仅有5种能被摄食，2种能被消化；Lora-Vilchis等[22]分别用10种单胞藻投喂卡塔琳娜扇贝(Argopectenventricosus)幼虫，仅有7种能被摄食，3种能被消化；邓正华等[21]用9种单胞藻投喂黄边糙鸟蛤(Trachycardiumflavum)幼虫，其更易摄食胞径较小的球形单胞藻，细胞裸露无细胞壁的单胞藻更易被消化。笔者用光学显微镜观察了不同日龄合浦珠母贝幼虫对苗种培育中常用的10种单胞藻的摄食与消化情况，给幼虫单独与混合投喂易摄食、易消化不同密度的单胞藻，比较幼虫的生长与成活状况，为幼虫培育选择合适的单胞藻饵料及投喂策略。

1 材料与方法

1.1 材料

2龄合浦珠母贝亲贝壳长约6 cm，取自中国水产科学研究院南海水产研究所热带水产研究开发中心陵水试验基地。挑选性腺饱满的个体，清除表面附着物，刷洗干净，置于阴凉处阴干刺激3 h，移入育苗水泥池中流水刺激，使其自然产卵、受精。24 h后受精卵发育至D形幼虫，用400目筛绢网滤出、清洗，再移至育苗水泥池中培养，密度为5 个/mL。幼虫培育期间日换水30%～50%，8:00和18:00混合投喂湛江叉鞭金藻(Dicrateriazhanjiangensis)与绿色巴夫藻(Pavlovaviridis)，投喂量为1×103～5×103个/mL。幼虫培育期间水温(27.03±1.22) ℃、pH 8.20±0.03、盐度28.45±1.20。

以上两种藻类在顶部直径90 cm、底部直径80 cm、高74 cm的玻璃缸纤维桶内，添加F/2营养液[23]，自然光照(0～5000 lx)下一次性培养。用于幼虫摄食和消化试验的10种单胞藻(表1)，在5 L锥形瓶中添加F/2营养液，于5000 lx(0 D∶24 L)光照下密封培养，每日摇晃锥形瓶2次，每5～7 d重新接种单胞藻。试喂时，10种单胞藻均处于快速生长期。

表1 用于饲喂幼虫的10种单胞藻胞径及主要特征

1.2 方法

1.2.1 幼虫对单胞藻的摄食与消化

受精后第2、8、14、18、22 d，自育苗池中取一部分幼虫，用孔径为47 μm的筛绢网过滤清洗后转移至过滤海水中饥饿12 h，然后放入分别装有400 mL密度为105个/mL 10种单胞藻液的10个500 mL烧杯中，幼虫密度为5个/mL。幼虫在含有单胞藻水体中摄食1 h后取出，在phenix-ph 50显微镜下观察幼虫对单胞藻的摄食情况。已摄食的幼虫，用孔径为47 μm的筛绢网过滤清洗后转移至过滤海水中。在幼虫摄食后的第1、2、4 h，每次、每组至少观察20个幼虫胃内单胞藻的消化情况。

1.2.2 幼虫摄食不同单胞藻的成活率

在5 个/mL幼虫的水泥池中，给幼虫投喂3组饵料：湛江叉鞭金藻、绿色巴夫藻及两种单胞藻数量比为1∶1的混合藻，每组饵料均设置3个平行。每日6:00、12:00、18:00和24:00投喂，投喂量为1×103～5×103个/mL，日换水30%～50%。每隔几日自培育池中取一部分幼虫，测量壳长(n=30)，受精后第22 d，用体积为1 L的采水器以9点法(培育池的8个顶角和中心)采集9 L水样，混合，自混合水样中取一定体积水样(幼虫个数大于500个)，滴入2滴NaClO2使幼虫沉淀，收集沉淀幼虫集中至1 mL浮游生物计数框中，用显微镜检测计数，统计幼虫成活率。

1.2.3 单胞藻投喂量对幼虫成活率的影响

在20 L培育桶中，以5个/mL的密度培养幼虫，每日8:00和18:00分别向培育桶内幼虫投喂2×103、20×103个/mL和40×103个/mL的湛江叉鞭金藻，每种密度均设置3个平行，培育桶日换水1次。幼虫培育至受精后第6 d，用筛绢网采集幼虫，在显微镜下测量幼虫壳长(n=30)，计数并统计幼虫成活率。

1.3 数据分析

试验数据以平均值±标准差表示，采用SPSS 21统计软件进行单因素方差分析，用LSD法多重比较各组间数值的差异显著性(P<0.05)；用Toup View图像分析软件对显微镜下放大后的幼虫进行拍照和测量大小；用Photoshop CS5对图像进行处理；用Origin 9.1做图。

2 结果与分析

2.1 幼虫对10种单胞藻的摄食与消化

幼虫对10种单胞藻的摄食、消化和空胃状态见图1。幼虫刚摄入单胞藻时，胃内可见完整的单胞藻；当单胞藻消化时，胃内单胞藻呈弥散状；单胞藻完全消化排泄时，胃空；消化盲囊吸收单胞藻营养物质，其颜色与单胞藻相同。

不同日龄幼虫对10种单胞藻的摄食与消化结果见表2。由表2可见，各日龄幼虫均能摄食小球藻、微绿球藻、湛江叉鞭金藻、绿色巴夫藻和球等鞭金藻；对亚心形扁藻、三角褐指藻和小新月菱形藻均不摄食，随着幼虫的生长，仅见部分或极少数幼虫摄食少量的杜氏盐藻和牟氏角毛藻。小球藻和微绿球藻很难被消化，在幼虫胃内未经完全消化就以完整细胞排出，湛江叉鞭金藻、绿色巴夫藻和球等鞭金藻则较易消化。随着生长，幼虫可摄食更大胞径的单胞藻，消化排泄能力也逐渐增强。

图1 合浦珠母贝幼虫对单胞藻的摄食、消化与空胃Ⅰ.胃中单胞藻细胞全部完整；Ⅱ.胃中单胞藻部分或全部裂解；Ⅲ.幼虫对单胞藻刚好完全消化排泄.

注：Ⅰ.胃中单胞藻完整； Ⅱ.胃中单胞藻部分或全部裂解； Ⅲ.单胞藻刚好被完全消化排泄； NO.未摄食； PAR.部分幼虫摄食； FEW.极少数幼虫摄食.

2.2 不同种类及密度单胞藻对幼虫生长与成活的影响

培育至受精后22 d时，摄食混合饵料的幼虫壳长与成活率分别为(195.91±19.00) μm、(11.33±0.98)%，摄食绿色巴夫藻的幼虫壳长与成活率分别为(179.23±16.60) μm、(10.32±0.99)%，摄食湛江叉鞭金藻的幼虫壳长与成活率分别为(172.14±13.32) μm、(7.34±0.98)%(图2)，表明混合饵料组幼虫的壳长和成活率均显著高于两种单胞藻单独投喂(P<0.05)，摄食绿色巴夫藻组幼虫壳长和成活率又显著高于摄食湛江叉鞭金藻的幼虫(P<0.05)。

幼虫培育中，湛江叉鞭金藻投喂量分别为2×103、20×103个/mL和40×103个/mL，培育至受精后第6 d时，随投喂单胞藻密度的增加，幼虫的生长速率和成活率均显著降低(P<0.05)(图3)。

图2 单独投喂湛江叉鞭金藻、绿色巴夫藻和二者等比例混合投喂时幼虫的生长与成活状况不同小写字母表示组间差异显著(P<0.05).

图3 合浦珠母贝幼虫摄食不同密度的湛江叉鞭金藻时的生长与成活状况同一颜色柱状图上方不同字母表示差异显著(P<0.05).

3 讨 论

3.1 幼虫对不同单胞藻的摄食与消化

本试验中，各日龄幼虫均能摄食小球藻、微绿球藻、湛江叉鞭金藻、绿色巴夫藻和球等鞭金藻，不摄食亚心形扁藻、三角褐指藻和小新月菱形藻，18日龄后部分或极少数幼虫摄食杜氏盐藻和牟氏角毛藻。这与企鹅珍珠贝幼虫[20]、黄边糙鸟蛤幼虫[21]、扇贝幼虫[22]、糙海参(Holothuriascabra)幼虫[24]和珠母贝(Pinctadamargaritifera)幼虫[25]等对单胞藻的摄食选择类似。这些结果表明，幼虫更容易摄食胞径较小且呈圆形的单胞藻。随着生长，幼虫摄食能力逐渐增强[26]，因此在18日龄后有部分和极少数的幼虫能够摄食胞径较大的杜氏盐藻和牟氏角毛藻。角毛藻富含海洋无脊椎动物幼虫正常生长发育所需的必需脂肪酸[27-29]，已在棘皮动物和双壳贝类幼虫培育中作为主要饵料或搭配饵料使用[25,30-31]。但在合浦珠母贝幼虫培育中并不适口，牟氏角毛藻呈方形或长条形，虽规格仅为5 μm×7 μm，但其生有4根长达20～30 μm的角毛，阻碍了幼虫的正常摄食[20,24,32]。胞径较小的单胞藻比胞径较大的单胞藻更易被幼虫摄食，这与稚贝和成贝的摄食结果正好相反[33-34]。稚贝和成贝主要以鳃滤食，随着单胞藻规格的增大从鳃丝漏掉的几率也就降低，因此对胞径较大单胞藻的摄食率高于胞径较小的单胞藻[35]。而幼虫阶段主要靠纤毛的不断摆动使单胞藻随水流进入幼虫口沟而被摄食[26]。单胞藻胞径大于幼虫口沟时则不能流入，不规则或长条形的单胞藻只有与口沟存在一定的恰当角度才能顺利进入口沟，因此幼虫更易摄食胞径较小、形状呈球形、表面光滑的小球藻、微绿球藻、湛江叉鞭金藻、绿色巴夫藻和球等鞭金藻等。

本试验发现，幼虫对湛江叉鞭金藻、绿色巴夫藻、球等鞭金藻和杜氏盐藻的消化率较高，但却较难消化小球藻和微绿球藻。这与糙海参幼虫[24]、扇贝幼虫[22]、企鹅珍珠贝幼虫[36]和美洲牡蛎(Crassostreavirginica)幼虫[37]对类似单胞藻的消化结果相同。湛江叉鞭金藻、绿色巴夫藻、球等鞭金藻和杜氏盐藻无细胞壁，在幼虫胃内经机械作用和消化酶的作用下，易被裂解、消化并排泄；而同属绿藻门的小球藻和微绿球藻具有一层纤维素细胞壁，很难被裂解和消化。未被消化的单胞藻在幼虫胃内微绒毛的摆动和胃自身收缩的条件下逐渐被排出。

3.2 不同投喂策略对幼虫生长与成活的影响

培养期间，湛江叉鞭金藻与绿色巴夫藻混合投喂时，合浦珠母贝幼虫的生长速率和成活率均显著高于两种单胞藻单独投喂(P<0.05)，而绿色巴夫藻组又显著(P<0.05)高于湛江叉鞭金藻组。就单胞藻混合投喂对幼虫的生长和成活高于单独投喂的效果，Martínez-Fernández等[12,15]在珠母贝幼虫培育中得出相同的结论。通常认为，多种单胞藻混合投喂避免了单一种类的营养不均衡，提高了饵料营养价值，更利于幼虫的生长和成活。然而，并非所有的饵料种类搭配对幼虫培育的生长和存活影响皆如此。Tang等[38]比较了球等鞭金藻及球等鞭金藻分别与杜氏盐藻、亚心形扁藻和三角褐指藻混合投喂对文蛤(Meretrixmeretrix)幼虫生长与存活的影响，发现3个混合藻组幼虫的生长和成活并不比单独投喂球等鞭金藻提高显著，其原因可能与其选择搭配的单胞藻种类有关。杜氏盐藻、亚心形扁藻和三角褐指藻与球等鞭金藻混合投喂时，幼虫对近乎球形且胞径较小的球等鞭金藻摄食效率高于其他3种单胞藻，混合投喂时，幼虫选择性的摄食球等鞭金藻，未能达到混合藻营养物质互补，提高其营养价值的效果。因此，在进行单胞藻混合搭配投喂时，应充分考虑单胞藻的形状、胞径大小、消化程度及营养物质组成等因素，保障培育的幼虫正常生长，提高成活率。

在一定密度范围内，随着单胞藻投喂密度的增加，幼虫生长速率和成活率均显著降低。这与投喂饵料密度过高导致蛤仔(Venerupiscorrugata)幼虫的生长速率与成活率[39]、文蛤的同化率[40]降低情况相似。邓正华等[21,41]将黄边糙鸟蛤幼虫和珠母贝幼虫放入105个/mL的单胞藻液中摄食1 h，发现幼虫在高密度单胞藻水体中一次性摄食过多，胃内单胞藻在微绒毛和胃自身收缩条件下，未经完全消化即完整排出体外。同时幼虫为了维持其对水的交换和自身浮游状态，其纤毛一直维持着摆动和摄食状态。因此，在幼虫培育中，幼虫一次性摄入过多单胞藻时，摄入的单胞藻未能充分被消化利用，也影响了幼虫的生长和存活。