猪伪狂犬病病毒PCR-LFD检测方法的建立及应用

张 莉，任卫科，李秀丽，路 超，王利丽，郑 丽，池晶晶，田向学，韩 伟，鄢明华

(1.农业部兽用药物与诊断技术天津科学观测实验站，天津 300381；2.天津市畜牧兽医研究所，天津 300381)

猪伪狂犬病(Pseudorabies，PR)是由疱疹病毒科、α-疱疹病毒亚科的伪狂犬病病毒(Pseudorabies viurse，PRV)引起的多种动物的一种高度接触性传染病[1]。猪是自然宿主。该病可导致怀孕母猪的流产、死胎、木乃伊胎和种猪不育等症状；哺乳仔猪常出现神经症状和死亡；成年猪一般呈亚临床或隐性感染，成为病毒的贮存宿主，长期排毒，但是自2011年后，我国多地区猪场中出现伪狂犬病病毒变异毒株，一些成年猪也出现神经症状和高病死率等情况[2-3]。猪伪狂犬病流行状况的变化给养猪业带来了巨大损失，因此，特异、敏感、快速的诊断方法对该病的防控至关重要。

目前，伪狂犬病的诊断方法有很多种，其中gE-ELISA方法和gB-ELISA常用于猪群的免疫抗体监测和预警，PCR方法和荧光定量PCR则是病原学诊断的主要方法[4]。PCR-LFD技术是将PCR技术、核酸探针杂交技术与横向流动试纸条(lateral flow dipstick,LFD)三项技术相结合，应用试纸条直接检测PCR扩增产物的技术。此项技术已在结核分支杆菌[5]、甲型H1N1病毒[6]、乙型肝炎病毒[7]、转基因黑曲霉[8]、口蹄疫病毒[9]等方面有了成功应用的报道。本研究根据猪伪狂犬病病毒的gE基因设计一套引物和探针，建立了猪伪狂犬病病毒的PCR-LFD特异性检测方法，为伪狂犬病的诊断提供了一种更为便捷的病原检测方法。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试病毒株和菌株 猪伪狂犬病病毒(PRV)SC株，由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所猪烈性传染病创新团队赠送；猪圆环病毒2型(PCV-2)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪细小病毒(PPV)、猪流感病毒(SIV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)R13028株、猪伪狂犬病病毒(PRV)R13139株、猪肺炎支原体(MP)、副猪嗜血杆菌(Hps)均由天津市畜牧兽医研究所实验室保存；猪链球菌2型(SS2)、猪伪狂犬病病毒(PRV)MinA株购自国家兽医微生物菌种保藏管理中心；猪伪狂犬病病毒Bartha-K61株(PRV gE基因缺失株)、日本脑炎病毒(JEV)、猪瘟病毒(CSFV)疫苗株为市售疫苗。

1.1.2 主要试剂 rTaqDNA聚合酶、dNTP、2XGCbuffer I、DNA Marker DL 2 000，宝生物工程(大连)有限公司产品；核酸提取试剂盒，金瑞鸿捷生物科技有限公司产品；横向流动试纸条，杭州忧思达生物技术有限公司产品。

1.2 方法

1.2.1 引物设计与合成 根据GenBank数据库中猪伪狂犬病病毒gE基因(GenBank：AY173124)中的一段保守核苷酸序列，采用Primer Preimer5.0软件设计特异性PCR引物和探针，由宝生物工程(大连)有限公司合成(表1)。

表1 引物序列

1.2.2 PCR-LFD方法的建立

1.2.2.1 PCR反应条件优化 PCR反应体系为20 μL：10 μL 2×GC buffer I，0.5 μL rTaqDNA聚合酶(8 U/μL)，2 μL dNTPs(2.5 mmol/L)，1 μL PRV gE247(10 μmol/L)，1 μL PRV gE623(10 μmol/L)，5.0 μL模板DNA，0.5 μL超纯水。PCR反应程序为：95℃ 5 min；94℃ 30 s，53℃至60℃ 30 s，72℃ 30 s，进行30个循环；72℃延伸5 min，4℃ 5 min。

1.2.2.2 退火温度的优化 固定其他条件不变，设定53、54、55、56、57、58、59、60℃共8个温度梯度，分别进行扩增，同时设立空白水对照。PCR反应结束，取8 μL PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，在凝胶成像仪上观察并记录结果。

1.2.2.3 引物浓度的优化 经上述筛选出最佳退火温度后，固定反应体系其他试剂的添加量，对引物浓度用量设定为0.5 μL、1 μL、1.5 μL、2 μL，并设立空白水对照。反应结束，用琼脂糖凝胶电泳检测结果。

1.2.2.4 探针杂交反应条件优化 PCR反应结束后，开盖加入1 μL Prv-T-bio(10 μmol/L)，增加一步杂交反应，94℃ 30 s，54℃至60℃ 30 s，4℃ 5 min。复性温度选择54、55、56、57、58、59、60℃分别进行杂交，摸索最佳反应条件。

1.2.2.5 LFD试纸条检测PCR产物 杂交反应结束后，取PCR产物10 μL加入到100 μL缓冲液，混合均匀；将LFD试纸条插入缓冲液3 min；取出将试纸条水平放置，5 min～10 min内读取结果。判定标准：质控线和检测线显现棕红色条带，为阳性；只有质控线显现棕红色条带，为阴性；只出现检测线为无效。

1.2.3 特异性试验 用已优化的PCR反应体系检测伪狂犬病病毒(PRV)SC株、伪狂犬病病毒(PRV)R13028株、伪狂犬病病毒(PRV)R13193株、伪狂犬病病毒(PRV)MinA株、猪伪狂犬病病毒Bartha-K61 株( PRV gE基因缺失株)、猪瘟病毒(CSFV)、猪圆环病毒2型(PCV-2)、猪猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪细小病毒(PPV)、日本脑炎病毒(JEV)、猪流感病毒(SIV)、猪肺炎支原体(MP)、副猪嗜血杆菌(Hps)、猪链球菌2型(SS2)。探针杂交后，用琼脂糖凝胶电泳法和LFD分别检测扩增产物，确定所建立方法的特异性。

1.2.4 敏感性试验 将已知TCID50的伪狂犬病病毒稀释为105～101个TCID50，按常规方法提取DNA，分别取5 μL作为模板，其他反应条件不变进行PCR扩增。探针杂交后，用琼脂糖凝胶电泳法和LFD分别检测扩增产物，确定所建立方法的敏感性。

1.2.5 琼脂糖凝胶电泳法和LFD试纸条灵敏度比较 以伪狂犬病病毒SC株DNA为模板，按照优化后的PCR条件进行扩增，反应结束后，测定PCR扩增产物的核酸含量，并用纯水做10倍、100倍、1 000倍稀释。分别取出20 μL稀释产物，加入1 μL核酸探针，探针杂交反应后，用琼脂糖凝胶电泳法和LFD试纸条分别检测扩增产物，比较两种方法的差异。

1.2.6 重复性试验 采用同一批次和不同批次提取的猪伪狂犬病病毒DNA作为模板分别进行5次PCR扩增，用琼脂糖凝胶电泳法和LFD法检测扩增产物，确定所建立PCR-LFD方法的重复性。

1.3 临床样品的检测

从养殖场采集50份病料样品，用病毒分离培养法和PCR-LFD方法同时进行检测，比较两种方法的符合率。

2 结果

2.1 退火温度的优化

选择53℃～60℃ 8个复性温度进行扩增，结果显示56℃和55℃均能扩增出特异的目的条带，而且56℃亮度最强，因此，最终确定56℃为最适反应温度(图1)。

1～8.60℃、59℃、58℃、57℃、56℃、55℃、54℃、53℃；9.阴性对照；M.DNA 标准DL 2 000

1-8.60℃,59℃,58℃,57℃,56℃,55℃,54℃,53℃;9.Negative control;M.DNA Marker DL 2 000

图1复性温度优化

Fig.1 Optimization of the annealing temperature

2.2 引物浓度的优化

固定PCR体系中其他试剂的添加量，将引物浓度用量设定为0.5、1、1.5、2 μL分别进行PCR扩增，结果显示，加入0.5 μL引物时，扩增条带稍浅；加入1、1.5、2 μL引物时，扩增条带均清晰，无明显引物二聚体，因此，1 μL为最佳引物添加量(图2)。

1.2 μL引物(阳性对照)；2.2 μL引物(阴性对照)；3.1.5 μL引物(阳性对照)；4.1.5 μL引物(阴性对照)；5.1 μL引物(阳性对照)；6.1 μL引物(阴性对照)；7.0.5 μL引物(阳性对照)；8.0.5 μL引物(阴性对照)；M.DNA 标准DL 2 000

1.2 μL primer(postive control);2.2 μL primer(negnative control);3.1.5 μL primer(postive control);4.1.5 μL (negnative control);5.1 μL primer(postive control);6.1 μL (negnative control);7.0.5 μL primer(postive control);8.0.5 μL (negnative contro);M.DNA Marker DL 2 000

图2引物浓度优化

Fig.2 Optimization of the primer concentration

2.3 探针杂交反应条件优化

PCR反应液中加入标记Biotin的探针，复性温度选择54、55、56、57、58、59、60℃分别进行杂交，然后用LFD试纸条检测，结果54、59、60℃试纸条检测线未出现阳性条带，55、56、57℃时检测线有明显阳性带，但55℃和56℃的检测线较浅，57℃检测线最为明显，因此认为94℃ 30 s，57℃ 30 s，4℃ 5 min为最佳的探针杂交反应程序(图3)。

1～7.54℃、55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃；8.阴性对照

1-7.54℃,55℃,56℃,57℃,58℃,59℃,60℃;8.Negnative control

图3探针杂交温度筛选试验结果

Fig.3 Temperature screening test results of
probe hybridization reaction

2.4 特异性试验

本试验建立的猪伪狂犬病病毒PCR-LFD检测方法检测伪狂犬病病毒(PRV)SC株、伪狂犬病病毒(PRV)R13028株、伪狂犬病病毒(PRV)R13193株、伪狂犬病病毒(PRV)MinA株、猪伪狂犬病病毒Bartha-K61株(PRV gE基因缺失株)、猪瘟病毒(CSFV)、猪圆环病毒2型(PCV-2)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRS)、猪细小病毒(PPV)、日本乙型脑炎病毒(JEV)、猪流感病毒(SIV)、猪肺炎支原体(MP)、副猪嗜血杆菌(Hps)、猪链球菌2型(SS2)。从图4可见所建立的PCR-LFD方法只能检测到伪狂犬病病毒SC株、R13028株、R13139株、MinA株，伪狂犬病病毒Bartha-K61株和其他对照菌毒株均为阴性，采用琼脂糖凝胶电泳和试纸条方法观察的检测结果完全一致。

2.5 敏感性试验

从图5可见，所建立的PCR方法的最低检测病毒滴度为102TCID50/100 μL，且采用琼脂糖凝胶电泳和试纸条方法的检测结果完全一致。

2.6 琼脂糖凝胶电泳法和LFD试纸条灵敏度比较

用核酸蛋白测定仪测定伪狂犬病病毒PCR扩增产物的核酸含量为482.5 ng/μL，将其稀释10倍、100倍、1000倍后，用琼脂糖凝胶电泳和LFD试纸条分别检测，结果见图6。从图中可看出当PCR产物稀释100倍后，已很难通过琼脂糖凝胶电泳观察到阳性结果，但是LFD试纸条仍可见较为清晰的红色检测线。说明LFD试纸条的灵敏度是琼脂糖凝胶电泳的10倍。

A.琼脂糖凝胶电泳检测；B.LFD试纸条检测；1.伪狂犬病病毒SC株；2.伪狂犬病病毒MinA株；3.伪狂犬病病毒R13028株；4.伪狂犬病病毒R13139株；5.伪狂犬病病毒Bartha-K61 株(gE)；6.猪圆环病毒2型；7.猪瘟病毒；8.日本乙型脑炎病毒；9.细小病毒；10.猪繁殖与呼吸综合征病毒；11.猪流感病毒；12.猪肺炎支原体；13.副猪嗜血杆菌；14.猪链球菌2型；15.空白对照；M.DNA 标准DL 2 000

A.Agarose gel electrophoresis; B.LFD strips; 1.PRV SC strain;2.PRV MinA strain;3.PRV R13028 strain;4.PRV R13139;5.PRV Bartha-K61 strain(gE-);6.PCV-2;7.CSFV;8.JEV;9.PPV;10.PRRSV;11.SIV;12.MP;13.Hps;14.SS2;15.Negnative control;M.DNA Marker DL 2 000

图4 PCR特异性试验

Fig.4 Specificity test of PCR

A.琼脂糖凝胶电泳检测；B.LFD试纸条检测；1.阴性对照；2～6.101 TCID50～105 TCID50；M. DNA 标准DL 2 000A.Agarose gel electrophoresis; B.LFD strips; 1.Negnative control;2-6.101 TCID50-105 TCID50;M.DNA Marker DL 2 000

A.琼脂糖凝胶电泳检测；B.LFD试纸条检测；1.阴性对照；2～4.103,102,10稀释的PCR产物；5.原倍PCR产物；M.DNA 标准DL 2 000

A.Agarose gel electrophoresis; B.LFD strips; 1.Negnative control; 2-4.PCR products diluted 103,102,10 times; 5.The original time PCR procucts; M.DL 2 000 DNA Marker

图6琼脂糖凝胶电泳法与LFD试纸条法灵敏度比较试验

Fig.6 The sensitivity comparison of agar gel electrophoresis and LFD strips analysis

2.7 重复性试验

取同一次和不同时间提取的猪伪狂犬病病毒DNA各5份，将其作为模板进行5次PCR扩增，用LFD试纸条和琼脂糖凝胶电泳法检测扩增产物，两种方法结果完全一致，说明所建立的PCR-LFD方法具有良好的重复性。

2.8 临床样品的检测

对养殖场送检的50份病料样品用PCR、病毒分离培养法和PCR-LFD方法同时进行检测，结果PCR检测到14份阳性，而病毒分离培养法和PCR-LFD方法为16份，PCR-LFD方法的敏感性要高于常规PCR方法。从表2可见PCR-LFD方法与病毒分离培养法的符合率为100%，与常规PCR方法的阳性符合率为100%，阴性符合率为94.4%。用SPSS17.0软件对结果进行评估，PCR-LFD方法与PCR的χ2为0.1904，P>0.05，两种方法无显著差别。

表2 两种方法检测结果比较

3 讨论

猪伪狂犬病是危害养猪业发展的重要传染病之一。对猪伪狂犬病病毒进行快速、及时、准确的诊断，是有效防控该病的重要前提。伪狂犬病病毒gE基因是其主要毒力决定因子，为病毒复制的非必需基因，也是世界动物卫生组织(OIE)所规定基因缺失疫苗的缺失基因。以gE序列作为靶序列建立的诊断技术，能够区分基因缺失疫苗接种与野毒感染[3]。王香玲等[10]根据猪伪狂犬病病毒gE基因序列保守区段，设计一对特异性引物，通过优化反应条件，建立了可区分猪伪狂犬病病毒野毒株与基因缺失疫苗株的PCR检测方法，该方法的敏感性为1.1 pg，有较高的特异性。张志等[11]建立了能够特异性检测PRV野毒株的套式PCR方法，该方法检测极限可达10个病毒拷贝/μL。田云等[12]建立检测伪狂犬病病毒野毒的荧光定量PCR方法，该方法的灵敏度可达4拷贝。常规PCR方法检测成本低，但需要琼脂糖凝胶电泳观察结果，且有时会出现假阳性结果。荧光定量PCR虽然敏感性高于PCR，可实时观看检测结果，但是需要昂贵的设备和试剂成本，不适用于基层实验室和规模化猪场使用。

本研究建立了一种基于猪伪狂犬病病毒gE基因的PCR-LFD检测方法，该方法是将PCR技术与LFD试纸相结合的一种可视化检测方法，在引物设计时将一条引物标记了异硫氰酸荧光素(FITC)，在PCR反应后，体系中加入了一条标记生物素(Biotin)的探针，只有目的基因的PCR扩增产物才能与探针结合。采用试纸条对PCR扩增产物进行检测，杂交形成的复合体带有Biotin和FITC两种标记，用试纸条检测时检测线和质控线均出现棕红色条带。阴性PCR产物、假阳性PCR和引物二聚体不具有双重标记，不能与检测线结合，检测线不显色。该方法在PCR扩增后15 min内即可目测判定结果，与传统凝胶电泳法相比更快速，且避免使用溴化乙锭(EB)等核酸染料造成的环境污染[8]。

为了避免PCR结果出现假阳性，本研究在PCR扩增完成以后，增加了特异性探针杂交反应，进一步提高了该方法的特异性。试验结果表明，该方法可特异性检测猪伪狂犬病病毒野毒株，与缺失gE基因的Bartha-K61株和其他9种猪病病原无交叉反应。此外，对比LFD试纸条法和琼脂糖凝胶电泳法对PCR扩增产物检测结果的灵敏度发现，PCR-LFD方法的最低检测限度为100TCID50/100 μL，其敏感性比应用琼脂糖凝胶电泳方法高10倍。

针对2011年以来流行的猪伪狂犬病病毒变异株分子特征发生变化的特点，在试验中分别对伪狂犬病病毒经典强毒双城株(SC株)和闽A株(MinA株)，新分离的猪伪狂犬病变异强毒R13139和R13028株，以及猪伪狂犬病病毒缺失gE基因的疫苗株Bartha-K61进行了检测，结果仅Bartha-K61株检测结果为阴性，其他4株PRV检测结果均为阳性，表明建立的方法适用于PRV经典强毒和变异的强毒株的检测。

以上结果表明，本研究建立的伪狂犬病病毒PCR-LFD检测方法具有敏感、快速、特异等特点，且操作简便、无需电泳可直接观察结果，可用于实验室、养殖场和基层兽医部门对伪狂犬病的诊断和监测预警，具有广阔的应用前景。