云南省西花蓟马种群遗传多样性ISSR分析

蒋兴川，蒋秀云，李志华，程 鹏，王晓晴，干春霞，桂富荣

西花蓟马(Frankliniella occidentalis Pergande)属缨翅目、蓟马科、花蓟马属，是一种世界性检疫害虫，其个体小，易隐藏，繁殖快，食性杂，可取食约66科500多种植物，并可传播植物病毒，现已成为全球范围内蔬菜、花卉及果树上的重要害虫之一[1-3]。该虫起源于美国和加拿大的西部地区[4]，现已传播至欧洲、亚洲、非洲、大洋洲、中美和南美洲等多个国家和地区[3]，我国北京、云南、浙江、山东等地区农作物也受到西花蓟马危害[1,3]。

云南气候类型丰富多样，拥有北热带、南亚热带、中亚热带、北亚热带、南温带、中温带和北温带七个气候带[5]；而西花蓟马从2000年首次在昆明被发现至今短短十几年，现已成为云南省多个气候带蓟马种类的优势种[6]。国内学者对中国部分地理种群的西花蓟马遗传分化进行了研究[7-11]，而有关云南省不同气候带西花蓟马遗传多样性的影响未见报道。

简单序列重复区间标记(Inter-simple sequence repeat, ISSR)具有操作简单灵敏、模板需求少、稳定性较高、成本低等优点，成为物种遗传多样性常用的检测方法[12]；目前已被广泛应用于植物、动物、微生物等物种的遗传多样性分析、资源鉴定与分类、亲缘关系、系统发育和品种资源鉴定相关研究领域[12-15]。本研究拟利用ISSR技术研究云南省不同气候带西花蓟马的遗传结构和遗传多样性，可为解析云南省西花蓟马的入侵来源、扩散方式及对其有效防治提供重要的理论基础。

1 材料与方法

1.1 供试虫源

在云南省的七个气候带中，前期调查发现海拔较高的北温带和中温带辣椒植株上未见西花蓟马危害。因此本研究于2011年～2012年采集其余五个气候带(北热带、南亚热带、中亚热带、北亚热带和南温带)的45个地区辣椒植株上西花蓟马样本(表1，图1)，按照刘宁等[16]的方法进行种类鉴定后，将西花蓟马浸入到85%的酒精中，置于-20℃冰箱中保存备用。

表1 供试西花蓟马样本信息

图1 云南省西花蓟马的45个采样点分布图
备注：数字代表的种群见表1，下同。

1.2 ISSR-PCR方法

ISSR引物及退火温度参照实验室前期研究结果[17]，委托上海生工公司合成(多态性引物信息见表2)。西花蓟马基因组DNA的提取及ISSR-PCR反应条件参照本实验室前期研究结果[18]，PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分析，使用Bio-Rad成像系统观察并拍照。

1.3 数据处理

数据处理方法参照柳青等[15]的方法。在遗传相似性系数的基础上，应用NTSYS-pc 软件包中的DCENTER和EIGEN程序进行主坐标分析(Principal coordinate analysis，PCOA)，测定各样本原始数据在系统树构建中的贡献大小。

2 结果与分析

2.1 西花蓟马ISSR-PCR扩增多态性分析

12条ISSR引物在45个西花蓟马采样点中共扩增出93个条带，其中多态性条带60个，占总条带数的64.52%，说明所检测的样品具有较高的遗传多样性。60条多态性条带中有39条由含(CT)n、 (AG)n和(GA)n等为主的二碱基重复系列引物扩增产生，占总多态性条带数的65.00%；有11条带是由含(ATG)n和(ATG)n三碱基重复系列引物扩增产生，占总数的18.33%(表2)。

表2 ISSR-PCR引物扩增结果

12条ISSR 引物的多态信息量(PIC)的范围在0.129(UBC879)到0.59(UBC864)之间，平均PIC值为0.36；其标记指数(MI)在0.647(UBC879)到6.432(UBC864)之间，平均MI值为2.97(表2)。不同引物间扩增条带数也存在着差异：在12条引物中，引物UBC864扩增出条带数最多，为11条；而引物UBC879扩增出条带数最少，仅为5条；不同引物间多态位点百分率也存在着差异，引物UBC835的多态位点百分率均为100.00%，而引物UBC879的多态位点百分率仅为20.00%(表2)。

2.2 西花蓟马种群的遗传分化分析

西花蓟马种群间的遗传距离见表3。由表可知：遗传距离介于0.000-0.318之间，其中种群KMAN(昆明市安宁县)和种群KMFM(昆明市富民县)的遗传距离最小(0.000)，而种群LJHP(丽江市华坪县)和种群HHYY(红河州元阳县)之间遗传距离最大(0.318)。说明入侵云南省的西花蓟马长期在不同气候环境的作用下，发生了一定程度的遗传分化，具有丰富的遗传多样性。

表3云南省西花蓟马45个种群间遗传距离

2.3 西花蓟马种群的聚类分析

云南省45个采样点西花蓟马系统聚类结果见图2。所有种群可分为五大类群，第一大类包括KMPL、KMCG、KMAN、KMFM、KMSM等10个种群，均属于北亚热带；第二大类均属于中亚热带，依次为KMJN、YXES、WSMG、WSWS、DLBC等10个种群；第三大类仅有HHYY、YXYJ、HHJP、BNML、BNJH这5个种群，除了HHYY属于中亚热带，其余4个种群均属于北热带；第四大类包含的西花蓟马种群数最多(13个)，分别是CXCX、CXNH、CXYA、BSLY这4个北亚热带种群，以及CXYM、LJHP、HHSP、PENE等9个南亚热带种群；第五大类均属于南温带，分别为LJYS、LJGC、LJNL、DLHQ、ZTZY、ZTLD、QJHZ。

图2 45个采样点西花蓟马的UPGMA聚类图

2.4 西花蓟马ISSR-PCR主坐标分析(PCOA)

应用NTSYSpc 2.0软件对西花蓟马ISSR-PCR结果进行两维空间主坐标分析，结果表明：45个采样点的西花蓟马分为5大类，其中北亚热带的CXCX等4个种群以及南亚热带的CXYM等8个种群聚为一类；北亚热带的KMPL等10个种群聚为一类；北热带的YXYJ等4个种群聚为一类；中亚热带的KMJN等9个种群聚为一类；南温带的LJYS等7个种群聚为一类(图3)。可见，PCOA的分析结果与UPGMA聚类结果在整体上趋于一致(图2-3)。然而也有少部分种群没有归到PCOA分析的任何类群，例如HHYY、LJHP、DLBC等地。因此，综合分析系统聚类结果和PCOA主坐标分析结果，才能准确解析西花蓟马不同地理种群的遗传差异。

图3 45个样点西花蓟马的主坐标分析

3 讨论与结论

简单序列重复区间标记 (ISSR)技术在遗传学研究中发挥着重要作用[12]。遗传变异是物种适应环境变化的必要条件，遗传多样性是检测物种的生存适应能力、进化潜力的重要指标，物种的遗传多样性越丰富，其对环境变化的适应能力就越强[15]。多态信息量 (PIC)、多态位点百分率(PPB)、标记指数(MI) 是衡量遗传多样性常用的指标[14]。本研究发现，云南省西花蓟马种群的PIC、PPB、MI值分别为0.36、64.52%、2.97，表明云南省西花蓟马种群遗传结构复杂、遗传异质性较高，具有丰富的遗传多样性，在不同气候带环境表现出很强的适应性。

种群间的遗传距离可揭示种群遗传分化的程度[14]。本研究发现45个西花蓟马种群的遗传距离系数介于0.000—0.318之间；UPGMA聚类与PCOA分析结果基本一致，均将云南省不同西花蓟马种群分为5大类，且相同气候带的西花蓟马种群大多聚为一类。这可能是由于云南省不同气候带的环境因素差异较大，对西花蓟马的生长发育及遗传变异产生了影响。Yang等[8]研究表明我国不同地区西花蓟马的遗传多样性存在着差异，且大理、保山及昆明的遗传多样性高于其他地区；张桂芬等[10]采用mtDNA标记技术，对我国13个省(市)不同地理种群西花蓟马的遗传结构和分化进行了研究，结果发现我国西花蓟马各地理种群之间可能已发生不同程度的遗传分化；这些研究与本研究结果一致。而沈荣登等[7,9]采用mtDNA标记技术研究了云南部分地区西花蓟马的遗传结构及其分化，结果表明各地理种群间的遗传分化程度很低，种群间存在基因交流；与本研究结果存在着差异，这可能是由于供试种群数量及分析方法不同导致的。

本研究利用ISSR技术对云南省不同气候带西花蓟马的遗传多样性进行了研究，明确了其遗传多样性水平，为揭示西花蓟马不同地理种群间相互进化关系、解析云南省西花蓟马的扩散方式及对其有效防治提供重要的理论基础。