芥菜型油菜WRKY71转录因子基因家族的鉴定及表达分析

袁玉辉，王舸泓， 董浩然， 宋博文， 刘显军

(宜春学院 生命科学与资源环境学院，江西省作物生长发育调控重点实验室，江西宜春 336000)

芥菜型油菜(Brassicajuncea)属于十字花科芸薹属，具有抗旱、抗裂荚、耐热、耐贫瘠等特点，在中国西部地区、印度北部等广泛种植，在澳大利亚、加拿大、俄罗斯中部、西西伯利亚、波兰等国家和地区也有种植，是一种重要的油料作物[1]。近年来，随着芥菜型油菜基因组序列的陆续公布[2-3]，芥菜型油菜的基因功能研究开启了新的时代。WRKY转录因子由于具有一个高度保守的WRKY结构域而得名[4]，是植物中一类重要的转录因子家族。WRKY结构域具有60个左右氨基酸，包括保守的WRKYGQK氨基酸和C末端具有1个锌指结构，锌指结构又具有2种类型CX4-5CX22-23HXH(C2H2)和CX7CX23HXC(C2HC)。根据WRKY结构域和锌指结构的特征，WRKY转录因子分为三类：第一类包括2个WRKY核心结构域和1个锌指结构C2H2，第二类包括1个WRKY核心结构域和1个锌指结构C2H2，第三类包括1个WRKY核心结构域和1个锌指结构C2HC[5]。大量研究表明，WRKY家族转录因子参与了植物的多种生理过程，如植物形态形成、器官衰老、物质代谢调控以及生物胁迫和非生物胁迫过程等等[6-8]。Wei等[9]克隆并分析了天蓝遏蓝菜的TcWRKY53，该基因同时受冷害、盐害和渗透胁迫的诱导表达；Jing等[10]分析了猕猴桃WRKY家族的基因，发现AcWRKY38、AcWRKY40、AcWRKY95、AcWRKY96对干旱和盐胁迫都有不同程度的响应；Xiao等[11]研究棕榈的WRKY基因家族功能发现，EgWRKY06、EgWRKY11、EgWRKY25、EgWRKY61、EgWRKY72和EgWRKY88等基因在冷害、干旱和盐胁迫下诱导差异表达。在拟南芥中研究表明，AtWRKY71调控植株株型形成、花期调控以及非生物胁迫[12-14]；Qin等[15]研究发现小麦通过TaWRKY71-1基因表达促进IAA向MeIAA的转化来改变生长素内在水平，调控下胚叶发育；邹克琴等[16]对水稻WRKY71研究发现，该基因与病害的抗性相关，但在油菜中WRKY71基因家族功能鲜见报道。

芥菜型油菜基因组序列虽已经公布[2]，关于芥菜型油菜WRKY71家族基因成员的研究未见报道。本研究利用芥菜型油菜‘紫叶芥’的基因组概览测序[17](genome survey sequencing, GSS) 序列中WRKY71基因家族序列设计简并引物，通过RT-PCR 技术获得芥菜型油菜WRKY71基因家族4个基因的完整序列，并采用实时荧光定量PCR技术研究该基因家族在不同胁迫条件下叶中的表达情况，为进一步研究该基因的功能奠定基础。

1 材料和方法

1.1 试验材料

以芥菜型油菜‘紫叶芥’为试验材料，于2017年9月种植于江西省作物生长发育调控重点实验室科研温室内，培养条件为温度28 ℃/18 ℃，光照16 h/8 h(白天/黑夜)。生长3周后，选生长健壮的苗，进行低温(4 ℃)、激素(100 mol/L ABA)以及盐(200 mmol/L NaCl)胁迫处理。处理后0、1、3、6、12和24 h分别采集叶片组织，相同的材料重复取样3次，用液氮速冻后放置-80 ℃冰箱保存备用。

1.2 试验方法

1.2.1RNA提取与BjuWRKY71s基因克隆芥菜型油菜叶片的总RNA提取参照TaKaRa公司的RNAiso plus产品说明书进行，RNA样品浓度由英国Biodrop uLITE分光光度计测定。cDNA第一链的合成参照TaKaRa公司的PrimeScriptⅡ 1st Strand cDNA合成试剂盒产品说明书进行。通过对芥菜型油菜GSS序列的检索，获得拟南芥AtWRKY71的同源序列。利用Primer 5.0设计简并引物(表1)，以芥菜型油菜叶cDNA为模板进行PCR扩增获，得BjuWRKY71s基因序列。扩增条件：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，58 ℃退火35 s，72 ℃延伸50 s，36个循环；72 ℃延伸10 min。PCR产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测；参照OMEGA琼脂糖凝胶DNA纯化回收试剂盒说明书对目的片段回收；采用pMD18-T载体连接回收产物；将连接产物转化至DH5α大肠杆菌感受细胞培养14～16 h；每对简并引物利用PCR鉴定8个阳性菌落送上海铂尚生物有限公司测序。

表1 引物序列

1.2.2芥菜型油菜WRKY71s的生物信息学分析通过DNAMAN6.0处理获得的芥菜型油菜WRKY71s序列，将其翻译成氨基酸序列，利用在线网站分析和预测BjuWRKY71s转录因子结构及功能。氨基酸理化性质的分析采用ProtParam(http://web.expasy.org/protparam/)，氨基酸序列的亲疏水性分析采用ProtScale(http://web.expasy.org/protscale/)，蛋白质磷酸化位点的分析采用NetPhos(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)，蛋白质二维结构的预测采用SPOMA(http://npsapbil.ibcp.fr/cgibin/ npsa_automat.pl? page=/NPSA/npsa_sopma.html)，使用同源模型软件SWISS-MODEL预测其三维结构。利用TargetP 1.1 Sever(http://www.cbs.dtu.dk/services/ TargetP/)进行BjuWRKY71s蛋白的亚细胞定位预测；使用Conserved Domains进行保守结构域的预测；使用Protfun预测其功能分类(http://www.cbs.dtu.dk/services/ProtFun/)；利用软件MEGA5.1采用N-J 法构建基因的进化树。

1.2.3芥菜型油菜WRKY71s基因的表达分析芥菜型油菜不同处理叶片的总RNA提取参照TaKaRa公司的RNAiso plus产品说明书进行，反转录按照TaKaRa公司PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time)试剂盒的说明书操作。使用Primer Primer 5.0设计实时定量引物(表1)，由上海生工合成，引物序列见表1。采用ABI StepOnePlus实时定量系统进行芥菜型油菜BjuWRKY71s基因表达分析，使用TaKaRa公司的SYBR®PremixExTaqTMⅡ (Tli RNaseH Plus)试剂盒。PCR反应程序：95 ℃预变性4 min，95 ℃变性5 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸10 s，共计40个循环。设置3个重复。采用2-ΔΔCt方法分析基因相对表达量。

2 结果分析

2.1 芥菜型油菜WRKY71s基因的克隆和染色体定位

根据芥菜型油菜的GSS序列设计2对简并引物，以芥菜型油菜叶的cDNA为模板，引物BjW71-1扩增结果约840 bp左右(图1)，PCR产物回收、连接、转化，阳性克隆测序后获得2个大小分别为822和840 bp扩增产物，分别编码273和279个氨基酸，并将其分别命名为BjuWRKY71-1和BjuWRKY71-2(图2)；引物BjW71-2扩增结果约840 bp左右(图1)，PCR产物回收、连接、转化阳性克隆，测序后获得2个大小分别为834和855 bp扩增产物，分别编码277和284个氨基酸，并将其分别命名为BjuWRKY71-3和BjuWRKY71-4(图2)。将克隆的BjuWRKY71s基因与公布的芥菜型油菜基因组序列进行Blast比对，4个BjuWRKY71s基因家族成员分布在3条染色体和1条scaffold上，分别为染色体A09、B04、A07和scaffold 144(表2)。

1．DL2000；2.引物BjW71-1；3.引物BjW71-2 图1 芥菜型油菜WRKY71s基因家族扩增产物1．DL2000；2. Primer BjW71-1；3. Primer BjW71-2Fig.1 PCR products of WRKY71s gene in B.juncea

2.2 芥菜型油菜WRKY71s基因编码蛋白的生物信息学分析

利用 ProtParam 预测分析 4个BjuWRKY71s蛋白的基本理化性质(表3)，这些蛋白的分子量为27.11～32.18 kD， 理论等电点为 7.75～9.08，负电荷的氨基酸残基数(Asp+Glu)为 26～32， 正电荷的氨基酸残基数 (Arg+Lys) 为 32～35， 脂肪系数为 51.31～59.75，不稳定系数为 36.69～63.71，总平均亲水性为 0.833～0.969，均为亲水性不稳定蛋白质。SOPMA 在线预测分析(表4)表明，这4个蛋白的二级结构从多到少依次都是无规则卷曲、α-螺旋、β-转角和延伸直链。其中无规则卷曲超过46.13%，是这4个BjuWRKY71s蛋白二级结构的主要组成部分。亚细胞都定位于细胞核上(表4)。

2.3 芥菜型油菜WRKY71s基因同源进化分析

将BjuWRKY71-1s的氨基酸序列在NCBI上做Blast序列比对分析，选取10个E值较高物种的序列，运用DNAMAN软件进行同源比较。结果(图2)表明，BjuWRKY71s基因家族的氨基酸与选取的10个物种氨基酸序列的保守区主要集中在WRKY结构域。利用Mega5.0软件对BjuWRKY71s基因与上述基因进化关系进行比较，BjuWRKY71s基因与白菜的亲缘关系最近(图3)。

表2 芥菜型油菜WRKY71s基因序列信息

表3 芥菜型油菜WRKY71s蛋白理化性质

表4 芥菜型油菜WRKY71s蛋白二级结构和亚细胞定位的预测

BrWRKY71. 白菜(NP_001288945.1)；EgWRKY71. 油棕(XP_010930927.1)；GhWRKY71. 陆地棉(AIE43914.1)；OsWRKY71. 水稻(AAT84158.1)；RcWRKY71.蓖麻(XP_025012488.1)；SbWRKY71. 高粱(XP_002451666.1)；SiWRKY71. 谷子(XP_004951681.1)；TaWRKY71. 小麦(ABN43177.1)；VaWRKY71. 山葡萄(AFK27602.1)；ZmWRKY71. 玉米(XP_008657117.1)；黑框部分为WRKY结构域图2 WRKY71s氨基酸多序列比对BrWRKY71. Brassica rapa(NP_001288945.1); EgWRKY71. Elaeis guineensis(XP_010930927.1); GhWRKY71. Gossypium hirsutum(AIE43914.1); OsWRKY71. Oryza sativa(AAT84158.1); RcWRKY71. Ricinus communis(XP_025012488.1); SbWRKY71. Sorghum bicolor(XP_002451666.1); SiWRKY71. Setaria italica(XP_004951681.1); TaWRKY71. Triticum aestivum(ABN43177.1); VaWRKY71. Vitis amurensis(AFK27602.1); ZmWRKY71. Zea mays(XP_008657117.1); WRKY domains are shaded in black frameFig.2 Amino acid sequence multiple protein sequence alignment of WRKY71s

2.4 芥菜型油菜WRKY71s基因胁迫表达分析

利用qRT-PCR分析芥菜型油菜WRKY71s基因家族在各种非生物逆境胁迫下的表达。图4显示，在200 mmol·L-1NaCl处理下，芥菜型油菜WRKY71s基因家族4个基因均受到诱导表达，BjuWRKY71-1、BjuWRKY71-2和BjuWRKY71-4这3个基因的表达模式相似，基因表达量随处理时间延长逐步升高，在6 h表达量最大(分别是对照表达量的15.7倍、4.2倍和90.3倍)，然后再降低；而BjuWRKY71-3在高盐诱导0～24 h逐步增高，到24 h是对照的9.2倍。

图3 芥菜型油菜WKRY71s与其他植物的WKRY71转录因子进化树分析Fig.3 Phylogenetic tree of BjuWRKY71s and WRKY71 transcription factors of other plants

由图5可知，在4 ℃低温处理后，芥菜型油菜WRKY71s家族基因受低温诱导24 h后都上调表达。BjuWRKY71-1、BjuWRKY71-2和BjuWRKY71-3这3个基因呈现先上调后下降，再上调的表达模式，且在24 h表达量最大；BjuWRKY71-4表现为先下降后上调，且24 h表达量是对照的36.6倍。

由图6可知，用100 mol/L ABA处理1 h后，BjuWRKY71-1和BjuWRKY71-2基因表达量先下降然后逐渐上调，在6 h时达到最大值，分别是对照的12.0和2.9倍，随后又下降，到24 h时它们的表达量仅为对照的0.4和0.1倍；而BjuWRKY71-3和BjuWRKY71-4基因在ABA处理后先表达上调，在6 h时表达量最大，分别是对照的6.3和70.5倍，随后相对表达量逐步降低。

不同小写字母表示显著差异水平(P<0.05)，下同图4 芥菜型油菜WRKY71s基因家族在盐胁迫下的表达The normal letters indicate significant difference at 0.05 level. The same as belowFig.4 Expression of BjuWRKY71s in response to salt stress

图5 芥菜型油菜WRKY71s基因家族在低温胁迫下的表达模式Fig.5 Expression of BjuWRKY71s under low temperature stress

图6 芥菜型油菜WRKY71s基因家族在ABA胁迫下的表达模式Fig.6 Expression of BjuWRKY71s in response to ABA stress

3 讨 论

过去20多年大量研究结果表明，WRKY转录因子对植物形态形成、种子发育、种子休眠和萌发、物质代谢以及生物胁迫和非生物胁迫过程的调控起着重要作用[18]。在拟南芥、小麦和水稻中已有报道，WRKY71基因家族调控植物株型形成、叶的发育、花期调控以及病害的抗性和非生物胁迫等[12-16]。但在油菜中，WRKY71基因家族基因结构鉴定和功能研究未有报道。

本研究利用生物信息学方法从芥菜型油菜的GSS序列中分离了4个WRKY71s基因，并通过RT-PCR方法确定了4个拷贝序列，其编码的蛋白长度各异，均具有典型的WRKY转录因子结构域保守氨基酸序列WRKYGQK，属于WRKY转录因子家族。从蛋白理化性质预测来看，4个芥菜型油菜WRKY71s 蛋白都为偏酸性, 且都属于不稳定的亲水性蛋白，这些相似的理化性质预示4个芥菜型油菜WRKY71s 蛋白间可能存在某些相似的功能。亚细胞定位结果表明4个芥菜型油菜的WRKY71s位于细胞核中，与水稻和葡萄的WRKY71转录因子定位结果一致，推测它们在细胞核中发挥转录调控功能[16,19]。芥菜型油菜是异源四倍体， A和B染色体上的基因存在高度同源性[2]，BjuWRKY71-1和BjuWRKY71-3这2个拷贝位于A染色体，BjuWRKY71-2位于B染色体，BjuWRKY71-4推测可能位于B染色体上，具体位置有待进一步研究。

为了研究芥菜型油菜WRKY71s基因家族在非生物胁迫下的反应，本试验采用盐(NaCl)、激素(ABA)、低温(4 ℃)对芥菜型油菜‘紫叶芥’进行处理，利用qRT-PCR分析检测了4个BjuWRKY71s转录因子的相对表达量，结果表明，芥菜型油菜WRKY71s家族基因在不同的处理作用下有不同的作用模式。在盐处理后，BjuWRKY71-1 、BjuWRKY71-2和BjuWRKY71-4这3个基因表达量先逐渐升高，在6 h表达量最大，然后降低，这与AtWRKY40同源的基因BnD11在油菜抗旱性品种“862”受到盐胁迫后的表型一致[20]，而BjuWRKY71-3在高盐诱导下0～24 h逐步增高。在4 ℃低温处理后，芥菜型油菜WRKY71家族基因受低温诱导24 h后都上调表达，BjuWRKY71-4基因上调的倍数最为显著，这与Kim等[21]对水稻OsWRKY71基因功能研究结果一致，推测BjuWRKY71s也可能通过调节下游靶基因在耐冷过程中起正向调节作用。ABA处理后，BjuWRKY71s基因表达先上调，在6 h时达到最大值，随后又下调表达逐步降低。在拟南芥中AtWRKY71受ABA处理后在0～12 h逐步上调表达与BjuWRKY71-3、BjuWRKY71-4在0～12 h表现基本一致[18]。4个BjuWRKY71s在非生物胁迫下都有不同的响应，BjuWRKY71-4在本研究的3个胁迫条件下响应最为敏感，可能在不同非生物胁迫下起重要的作用。

本研究利用芥菜型油菜GSS序列中分离出的BjuWRKY71s基因序列设计引物克隆，并定位了该基因在芥菜型油菜的染色体位置，利用生物信息学分析该基因家族的结构、进化和系统发生，并利用qPCR对该基因家族的基因在叶中对非生物胁迫响应表达做了分析，为进一步深入研究BjuWRKY71基因家族的功能奠定了基础。