pH和温度敏感型聚合物荧光探针的合成及应用

刘建川

（西华师范大学 化学化工学院，四川 南充 637000）

在临床中，生物标志物检测对于临床诊断及治疗方案的制定均具有积极作用，为此，多年来其一直作为临床医学界及相关研究人员的主要关注方向，所呈现出的研究资料众多。但是，传统小分子荧光探针在溶解度、集成等方面还存在一定局限性[1]。以往有研究资料显示，经由相应的化学方法应用，能够促使小分子荧光探针融入聚合物体系中，从而形成功能性更为全面的聚合物探针，其与传统荧光探针进行对比，所呈现出的主要差异是生物相容性有进一步提升，其检测功能也实现了集成化[2]。在本次研究中，对pH和温度敏感型聚合物荧光探针的合成及具体应用进行了分析，现报告如下。

1 实验材料及方法

1.1 实验仪器

仪器：Bruker Avance 400核磁共振仪NMR，四甲基硅烷作为内标，测定环境在常态室温条件下即可；Waters LCT Premier XE TOF型高分辨质谱仪；VARIAN Cary 100型紫外可见吸收光谱仪与CARIAN-Cary型荧光光谱仪；LAKECORE-SO400型超纯水器；pHS-25型pH计；Waters1515-2414型凝胶渗透色谱仪，流动相为四氢呋喃。试剂：偶氮二异丁腈（AIBN）分析纯，经乙醇重结晶纯化；N-异丙基丙烯酰胺（NIPAM），分析纯，经正已烷重结晶纯化；单氨基-七异丁基POSS，分析纯；四氢呋喃（THF），分析纯，应用前经金属钠干燥与蒸馏，保存留用。

1.2 方法

1.2.1 NI（N-（2-甲基丙烯酰乙酯基）-4-（N-甲基哌嗪基）-1，8-萘酰亚胺）的合成

在容量为100 mL的实验专业容器中，将N-（2-羟乙基）-4-（N-甲基哌嗪基）-1，0-萘酰亚胺（600 mg，1.8 mmol）溶到20 mL干燥二氯甲烷中，然后在此容器中增加三乙胺，剂量为0.25 mL，增加后不断进行搅拌；将10 mL二氯甲烷溶解的甲基丙烯酰氯溶液，缓慢地注入容器中，本次研究中此环节采用滴注的方式，确保溶液能够维持一定速度缓慢进入容器；将配置好的溶液放置在常温环境中，促使其自然反应12 h。反应后的溶液减压旋蒸除去溶剂，柱层析色谱分离，二氯甲烷/甲醇，获取到黄色产物NI 330 mg，产率为46%。

1HNMR（400MHz，CDCI3），δ：1.87（s，3H，-CCH3），2.46（s，3H，-NCH3），2.77（s，4H，-（CH2）2N-），3.32（s，4H，-（CH2）2NCH3），4.47（t，J=5.2HZ，2H，-NCH2-），4.54（t，J=5.2HZ2H，-CH2O-），5.50（s，1H，alkene-H），6.05（s，1H，alkene-H），7.22（d，J=8.0HZ，1H，Ph-J），7.69（t，J=7.2HZ1H，Ph-H），8.40（d，J=8.4HZ，1H，Ph-H），8.25（d，J=8.0HZ1H，Ph=H），8.57（d，J=7.2HZ1H，Ph-H）。HRMS（ESI-MS）：计算值C23H26N3O4[M+H]＋408.192 3，实际测量结果为408.193 3。

1.2.2 POSS-CTA（双硫酯基-异丁基-POSS链转移剂）的合成

在容量为100 mL的容器中，加入AOPOSS，剂量为2 g，将其溶解到50 mL干燥二氯甲烷中，持续进行搅拌；在搅拌一定时间后，将2-溴丙酰溴（0.65 g，3 mmol）的20 mL干燥二氯甲烷稀释液注入容器中，本次研究采用滴注方式，促使其能够维持一定速度缓慢进入到容器中，将配置完成的溶液放置到常温环境中，使其自然反应12 h。自然反应完成后减压旋蒸除去溶剂，乙醇重结晶，真空干燥获取到白色固体POSS-Br2.08 g，收率87%。

1HNMR（400MHz，CDCI3），δ：0.63-0.58（m，15H，-SiCH2-），0.96（d，J=6.8HZ，42H，-CH（CH3）2-），1.67-1.58（m，2H，-SiCH2CH2-），1.89-1.80（m，7H，-SiCH2CH-），1.89（d，J=6.6HZ，3H，-CHBrCH3），3.27（q，J=6.8HZ，2H，-NHCH2-），4.41（q，J=6.6HZ，1H，-CHBrCH3），6.41（s，1H，-NH-）。HR MS（ESI-MS）：计算值C34H75NO13Si8Br[M+H]＋：1 008.257 6，实测值1 008.257 1。

1.2.3 Poly（POSS-NI-NIPAM）合成

选用容量为25 mL的史莱克管作为容器，首先在容器中加入N-异丙基丙烯酰胺，加入量为0.567 g，5.010 mmol，后加入链转移剂POSS-CTA，加入量为35 mg，0.033 4 mmol，后加入NI，加入量为10 mg，0.024 6 mmol，后加入1mL干燥四氢呋喃与AIBN，加入量为2.4 mg，0.016 7 mmol。在所有试剂均添加完成后，进行冻融脱气循环，反复操作3次，完成此项操作后对其进行加热处理，至65 ℃停止加热，自然反应9 h。将完成反应后的液体缓慢滴入到200 mL的冷乙醚中进行沉淀处理，持续沉淀2次，最终形成颜色为黄色的固体，重量为0.547 g。最终获得物质数均相对分子质量12 565，质均相对分子质量18 353，多分散性指数PDI1.46。

2 结果

2.1 合成与表征

POSS-CTA的合成经由两步有机合成反应合成RAFT反应链转移剂POSS-CTA。（1）AIPOSS与2-溴丙酰溴经由亲核加成与消除反应获取到热力学稳定的中间体POSSBr。（2）将丙酮作为溶剂，乙基黄原酸钾上硫原子亲核进攻POSS-Br，生成溴化钾与链转移剂POSS-CTA、此种合成策略较为简便，且合成过程所应用到的原料容易获取。

2.2 Poly（POSS-NI-NIPAM）结构

从N-异丙基丙烯酰胺开始，以无水四氢呋喃作为溶剂，AIBIA作为链引发剂，POSS-CTA作为链转移剂，合成共聚物Poly（POSS-NI-NIPAM）。经由1H-NMR与GPC对Poly结构及相对分子质量分别进行表征。在Poly核磁共振氢谱中，萘酰亚胺单元中-OCH2CH2N-的亚甲基氢化学位移出现在4.39位置，茶酰亚胺中甲基哌嗪基团的-CH3甲基氢，聚合物核磁氢谱结果充分显示出各单位均成功参与聚合反应。GPC测试结果显示出，Poly数均相对分子质量（Mn）为12 565，质均相对分子质量（Mw）为18 353，多分散性指数1.46。此结果充分证实，应用RAFT反应生成的聚合物相对分子质量可控，且分布均匀。详细情况如图1所示。

图1 Poly在DMSO-d6的核磁共振氢谱图

针对不同浓度茶酰亚胺单体NI的吸收光谱实现滴定测试，同时将其在400 nm处的吸光度值与质量浓度变化做线性关联，获取公式为：

A：A400=9.944 6c-0.001 14，R=0.999 9，公式中浓度为1.0 g/L Poly溶液在吸收光谱400 nm位置吸光度为A400=0.369 85，代入公式获取到聚合物中单体NIPAM与NI之间摩尔比为233∶1。

2.3 探针与pH变化响应检测

经由对系统测试条件的优化，茶酰亚胺单体在乙醇溶液中荧光量子产率较高，将Poly水溶性作为考虑因素，各光谱测试均应用V（水）∶V（乙醇）=9∶1体系。考虑到萘酰亚胺单体NI对pH优异的响应性能，对聚合物探针Poly处于不同pH条件下实现光谱性质试验。紫外-可见吸收光谱显示出，在pH从10.0到2.2过程中，Poly最大吸收波长轻微篮移，且在200 nm部位出现等吸收点。应用等吸收点400 nm作为激发波长，在pH为10.0时，Poly初始状态的荧光较弱，其原因可能为萘酰亚胺与哌嗪基团临近氮原子之间PET过程致使萘酰亚胺荧光猝灭。随着pH的持续降低，能够发现萘酰亚胺中哌嗪单元发生质子化反应，PET过程在被动状态下停止，NI荧光强度逐渐恢复，荧光强度变化与pH变化呈现良好线性关系。

2.4 探针对温度变化响应检测

为明确荧光探针是否会受到温度条件的影响，在本次研究中特对探针在温度变化中的响应情况进行了观察，调查结果显示出，低温环境中，可观察到较为清澈的溶液，随着温度的不断上升，原本清澈的溶液会逐渐浑浊。基于pH=7.14条件，Poly处于25 ℃状态下，在400 nm部位吸光度出现显著变化，代表着聚合物在此过程中发生从亲水到疏水的变化。聚合物体系Poly在520 nm位置荧光在温度的不断升高下而有所降低，仅在相转变时，荧光强度会逐渐加强。此结果代表着在温度的不断升高下，萘酰亚胺分子热运动致使荧光逐渐猝灭，在温度至LCST时，微环境从极性变化为非极性，聚合物在溶液中从伸展的线团结构变化为紧密的球状结构，荧光表现为突然增强。另外，实验结果显示出，探针在pH变化（4.22/10.09）与温度变化（20～40 ℃）时，Poly荧光强度可逆循环性能良好，代表着Poly适合成为聚合物荧光传感器检测pH/温度变化的材料。

3 讨论

荧光探针是其荧光性质能够在周围环境性质的转变下而作出适当改变的一种荧光性分子，主要作用为探究大分子物质的性质与行为[3]。荧光探针多应用在荧光免疫法中标记抗原或是抗体，同时也可应用在微环境中的探测，包括表面活性剂胶束、双分子膜等[4]。应用可逆加成断裂自由基聚合反应设计合成基于萘酰亚胺染料与N-异丙基丙烯酰胺单体的pH/温度双响应聚合物荧光探针Poly。

一系列实验证实，探针在pH变化（4.22/10.09）与温度变化（20～40 ℃）时，Poly荧光强度可逆循环性能良好，探针在pH5.8～8.0条件中，pH检测性能较好，荧光变化与pH成线性相关，Poly对pH及温度具有教好可逆循环检测性能，代表着Poly适合应用在聚合物荧光传感器检测pH/温度变化中[5]。

Poly适合成为聚合物荧光传感器检测pH/温度变化的材料，在生物样本pH/温度变化检测中具有较大应用价值。