利用过氧化氢酶活性鉴别药用原料乳猪肝和成年猪肝研究

2018-12-05罗清荣李雪雁郑泽鑫

现代盐化工 2018年5期

罗清荣，李雪雁，郑泽鑫，杨林，李玲，谢果

（电子科技大学中山学院，广东中山 528402）

1 猪肝营养概述

猪肝含有丰富的铁、磷，还富含蛋白质、卵磷脂和微量元素，具有重要的营养价值。自20世纪80年代，从乳鼠和部分切除的肝组织提取出生物活性物质以来，对于肝脏提取物中活性成分的研究一直受到广泛关注。

目前，从猪肝脏中可以提取制备肝素、猪肝酯酶、卵磷脂、肝水解肽等生化药剂，具有重要的药用价值。其中促肝细胞生长素是从新鲜乳猪肝或未哺乳新生牛新鲜肝脏中提取的一种能够促进肝细胞再生的生物活性物质，主要用于治疗各种重型病毒性肝炎、慢性肝炎等疾病。实验表明，参考促肝细胞生长素的生产工艺，以乳猪肝为原料制备肝水解肽，与成年猪、牛肝脏为对照，考察产品活性及收率差异，结果证明乳猪肝源制品的生物活性远高于成年猪、牛肝源制品，且含量及收率亦有所提高。

从临床用药的有效性考虑，以两个月以内的乳猪肝代替成年动物肝脏制备的肝水解肽具有较高的应用价值，应当成为制药企业的原料标准。但是，基于成本考虑，成年猪肝比乳猪肝价格低，而仅凭外观又无法准确区分乳猪猪肝和成年猪猪肝，因此，可能出现企业收购的乳猪肝脏被成年猪肝脏所替代的风险。目前国内没有检测成年猪肝和乳猪肝的标准和方法，造成企业收购猪肝质量检测空白和质量检测监督部门的监管空白。为了解决这一问题，急需研究出一个适于常规检测的方法，以区别来源于成年猪和乳猪的猪肝。

过氧化氢酶广泛存在于动植物的各个组织、大部分需氧微生物体内，是动植物体内清除自由基的基本酶类[1]。过氧化氢酶的作用是催化细胞内过氧化氢的分解，防止脂质、蛋白质、核酸等生物大分子的氧化损伤[2]。动物体内一般不同组织的过氧化氢酶活性不同，基本由大到小的排序是：肝、肾、肺、心、脾、胃、脑[3]。不同生长阶段中，由于代谢能力的差异，动物肝脏中的过氧化氢酶的酶活性也存在差异。本文利用碘量法测定过氧化氢酶的酶活性大小，通过研究对比成年猪和乳猪的猪肝中过氧化氢酶的活性差异，建立简单有效的生化检测方法，鉴定成年猪肝和乳猪肝，实现药企和监管部门常规检测和监管，从而保障乳猪肝源药品的质量。

2 实验材料

2.1 猪肝

成年猪肝在菜市场购买。乳猪肝由广东中山市隆赋药业提供。

2.2 试剂

pH分别为6、7、8、9的1%甘露醇缓冲溶液（内含0.1 mol/L的磷酸盐），保存于4 ℃的冰箱中；40 g/L钼酸铵溶液，0.15 mol/L Na2S2O3标准溶液，0.155 mol/L KCI溶液，0.9%NaCI溶液，0.1 mol/L高锰酸钾标准溶液。

3 实验方法

3.1 粗酶液的提取

本实验采用缓冲液提取法来提取猪肝中的过氧化氢酶，先用纸巾擦净猪肝表面的血水，将猪肝剥去膜衣，切去结缔组织后称重，取成年猪肝10 g，按所需的料液比1∶8（猪肝：1%甘露醇磷酸缓冲溶液）及pH[4]加入相应的1%甘露醇磷酸缓冲溶液（内含0.1 mol/L的磷酸盐），记号。分别于匀质机中在2 000 r/min下搅碎30 s左右，制得的匀浆液分别在10 000 r/min下离心10 min，取上清液1 mL，最后用1%甘露醇磷酸缓冲溶液稀释10倍，制得粗酶液。

3.2 过氧化氢酶活性测定方法

测定过氧化氢酶活性是利用过氧化氢酶能分解过氧化氢的特性，用一定量的粗酶液在25 ℃的条件下与足量的过氧化氢反应规定时间后，终止其反应。通过测定剩余过氧化氢的量，来计算猪肝中过氧化氢酶的活性。

计算公式：

将冷藏4 ℃冰箱内的成年猪肝和乳猪肝，取出置于冰水浴中解冻。按粗酶液提取方法，称取已冷藏的猪肝10 g，分别加入料液比为1∶8，pH为7.0、8.0、9.0的1%甘露醇磷酸缓冲溶液，制备猪肝粗酶液，做好标记，置于冰水浴中待用。用Na2S2O3测定其酶活性，平行测定3次，并做空白对照组。

4 实验结果与分析

实验结果与分析如表1～3所示。

表1 成年猪肝与乳猪肝中过氧化氢酶的活性对比实验数据（耗用Na2S2O3体积，单位：mL）

表2 成年猪肝与乳猪肝中过氧化氢酶的活性对比实验结果［单位mg·g-1·min-1］

实验数据分析结果：行对比F＞Fcrit，且Pvalue＜0.01，这说明乳猪肝和成年猪肝过氧化氢酶活性两组数据差异极其显著。

5 结语

肝脏中含有的活性物质有过氧化氢酶、线粒体F1-ATP合酶、谷氨酸脱氢酶、辅酶A等。其中过氧化氢酶在机体中广泛存在，其中主要存在于细胞的过氧化物酶体内，约占过氧化物酶体酶总量的40%，被认定为是过氧化物酶体的标志酶。孔德胜等[3]研究发现过氧化氢酶的分布特点除具有一定的组织差异外，其量的多少还和动物的发育时期有关，同时受环境因子的影响。已报道小鼠各组织CAT的活性随着年龄的变化表现出较大差异。小鼠肝、肾组织中过氧化氢酶的活性在1～4月龄间与年龄相关性不显著，在4～18月龄间随年龄增加而降低。小鼠肝、肾、肺、心、脾、胃、脑等组织中过氧化氢酶的活性随年龄变化而变化，机体过氧化氢酶活性的降低与机体衰老密切相关[4]。关于过氧化氢酶活性在猪的组织（包括肝脏）中随年龄分布的情况未见报道。本实验显示，乳猪肝中过氧化氢酶活性比成年猪肝的过氧化氢酶活性低，而且两者差异极其显著。通过研究发现，乳猪和成年猪的猪肝中过氧化氢酶活性存在明显差异，可作为鉴别两者的一个生化指标。