基于SWATH技术筛选影响乌珠穆沁羊肉品质的蛋白

谢遇春，米 璐△，车天宇，奈日乐，马丽娜，杨 峰，王志新，苏 蕊，张燕军，王瑞军,，赵艳红，王志英，何利兵, 刘志红*，李金泉*

(1.内蒙古农业大学 动物科学学院，动物遗传育种与繁殖自治区重点实验室，农业部肉羊遗传育种重点实验室，内蒙古自治区山羊遗传育种工程技术研究中心，内蒙古 呼和浩特 010018;2.内蒙古金莱牧业科技有限责任公司，内蒙古 呼和浩特 010100)

乌珠穆沁羊为内蒙古特有品种，其肉质鲜嫩，而且耐粗饲，适合在天然草场放牧，素有“天下第一羊”的美誉。沙里[1]研究显示乌珠穆沁羊中氨基酸含量丰富，尤其是8月龄乌珠穆沁羊氨基酸含量最高，且人体必需氨基酸异亮氨酸在8月份乌珠穆沁羊中积累最为丰富。众所周知,肌肉除了水分之外主要由蛋白质组成，氨基酸组成不同导致蛋白质差异，而蛋白质的形成是一个复杂的转录翻译的过程，故对不同部位肌肉进行蛋白质组成及差异探究对进一步探索肉质差异有着重要意义。

肉的颜色、系水力、pH、嫩度、风味及肌内脂肪含量是衡量肉品质的重要指标，而肌纤维类型对肌肉的pH，失水率，肉色等有着显著的影响[2-5]。肌纤维类型可在代谢特征、收缩功能、肌球蛋白重链(MyHC)的多态性三个方面进行分类，根据其代谢特征可将肌纤维分为有氧代谢型和酵解代谢型。根据肌肉的收缩功能肌纤维可以分为Ⅰ型和Ⅱ型，依据肌球蛋白重链(myosin heavy chain, MyHC)的多态性，可分为Ⅰ型、Ⅱa 型(快速氧化型)、Ⅱb 型(快速酵解型)和Ⅱx 型(中间型)[6-9]。而本研究意在利用各种影响肌肉品质的因素筛选影响肌肉品质的差异蛋白，为进一步探索其机制奠定基础。目前，有关乌珠穆沁羊不同部位肉质的研究较少，采用液相色谱-质谱联用技术[10-14]对乌珠穆沁羊的研究更是凤毛麟角。为了揭示乌珠穆沁羊肌肉蛋白表达的差别及对应差异蛋白对该部位肉品质的影响，本研究采用SWATH方法，对乌珠穆沁羊背最长肌、臀部肌肉进行蛋白质定性和定量分析，找到了臀部肌肉和背最长肌总蛋白以及对肉质品质有显著影响差异蛋白，同时也为肉品质的快速鉴定与溯源提供了新方法。

1 材料与方法

1.1 试验材料

样本采自内蒙古乌珠穆沁旗，采集3只8月龄乌珠穆沁羊背最长肌与臀部肌肉两个部位样本。

1.2 试验方法

1.2.1 总蛋白提取 取适量样品置于液氮中研磨，加入1%SDS裂解液，室温放置20 min，每隔1 min在涡旋仪上涡旋30 S，超声破碎2 min，4 ℃，12 000 r/min 离心30 min，取上清。使用BCA(Bioteke)试剂盒进行总蛋白浓度测定。

1.2.2 总蛋白酶解 100 μg总蛋白加入200 μL 8 M尿素与10 mM DTT，37摄氏度变性1 h，12 000 rpm离心40 min，加入200 μL尿素、震荡、12 000 rpm离心30 min重复两次，加入200 μL 50 mM IAA避光反应30 min，12 000 rpm离心30 min。加入100 μL碳酸氢铵，12 000 rpm离心20 min，重复3次。加入适量trypsin 37 ℃孵育过夜。12 000 rpm离心30 min。加入50 μL碳酸氢铵，12 000 rpm离心30 min，重复2次。收集滤液，冻干，准备上机。

1.3.3 液相色谱质谱连用采集数据 取适量肽段冻干粉，A相复溶，上机获取IDA与SWATH数据。离子源: IDA扫描模式:正离子;喷雾电压: 2.3 kV;离子源温度: 150 ℃。蛋白鉴定模式: 一级扫描模式: 全扫描; 一级扫描范围: m/z 150～1 200; TO分辨率设为30 000; 选择窗口: 0.4 Da；碎裂模式：CID; 碎裂能量: 动态碎裂; 二级扫描范围: m/z 100～1 500; 循环模式: 动态排除扫描; 动态排除时间: 18 s; SWATH定量模式: 一级扫描模式: 全扫描; 一级扫描范围: m/z 150～1200; TOF分辨率设为30 000; 间隔窗口25 amu; 碎裂模式: CID; 碎裂能量: 动态碎裂; 二级扫描范围: m/z 100～1 500;循环模式: 依次均匀扫描。

1.3.4 生物信息学分析

1.3.4.1 蛋白鉴定 将液相色谱质谱连用采集的背最长肌肉与臀部肌肉IDA数据利用Protien Pilot4.5软件进行搜库，蛋白数据库来源于UNIPROT/SWISS-PROT。

1.3.4.2 保留时间校准 利用Peak View软件，对背最长肌肉与臀部肌肉的SWATH数据与IDA数据进行比对，进行保留时间校准，做定量分析。

1.3.4.3 差异蛋白的筛选 应用Marker View软件的T检验绘制火山图，筛选2组数据的PValue值与Fold Change的log值等两个因素绘制，横坐标代表差异倍数，纵坐标代表PValue值，且Fold Change以2为底的对数变换。以PValue值<0.05、差异倍数> 2或 < 0.5作为阈值选取背最长肌肉与臀部肌肉的差异蛋白。

1.3.4.4 在uniprot数据库(http://www.uniprot.org/)中对差异蛋白查询并注释其功能。

2 结果与分析

2.4 总蛋白提取结果

取30 μg蛋白进行SDS-PAGE电泳检测，电泳检验蛋白质提取效果如图1所示。由图1可以看出，蛋白质提取效果较好，上样量一致，蛋白条带均一，条带清晰，说明蛋白浓度测定精准，可用于后期试验。

图1 SDS-PAGE电泳图M.Marker蛋白分子量标准品；A.背最长肌肉；B.臀部肌肉；1-3代表生物重复Fig.1 Electrophoresis diagramM.Standard of Marker protein molecular A.Represents the longest muscle in the back;B.Represents the buttock;1-3. Represents the biological repetition

2.2 乌珠穆沁羊肉总蛋白鉴定

本研究以UniProt/Swiss-Prot数据库为背景，对背最长肌和臀肌肌肉蛋白质进行鉴定，建立了背最长肌肉和臀肌肌肉的蛋白质表达谱。结果显示，在1%假阳性条件下，共搜索到1003种蛋白质与18667种肽段，如图2所示。

2.3 蛋白主成分分析

主成分分析是利用教学方法，将可能存在相关的一组蛋白质组数据转化为一组不相关的新变量的分析方法[15]。在本次试验中，样本点之间距离越远，说明蛋白表达差异越大。本试验通过主成分析构建反应背最长肌和臀肌两个部位差异蛋白质组的分析图(图3)，直观地显示了两组分布在不同的区间，说明背最长肌与臀肌肌肉的蛋白质组成有较大差异。

图2 总蛋白搜库结果Fig.2 Result of database search

图3 主成分分析a、b分别代表背最长肌和臀肌肌肉，1,2,3代表生物重复。Fig.3 Principal component analysisa and b represent the longissimus dorsi and gluteusmuscles respectively;1,2,3 represents biological duplication

2.4 背最长肌肌肉和臀部肌肉差异蛋白鉴定

如图4所示，乌珠穆沁羊肌肉差异蛋白火山图，共筛选出背最长肌和臀部肌肉的差异蛋白62个，在差异显著的蛋白中上调为11个，下调为51个。

在上调的11个差异蛋白中分析了7个与肉品质关系较大的蛋白，结果表明 ：在代谢方面Long-chain-fatty-acid-CoA ligase 1、Acyl-protein thioesterase 1及 Peptidyl-prolyl cis-trans isomerase NIMA-interacting 1蛋白主要参与长链脂肪酸的激活、脂肪代谢及氨基酸的修饰与调控；在肌肉收缩方面Parvalbumin alpha、30S ribosomal protein S6、Sarcoplasmic/endoplasmic reticulum calcium ATPase 3 、蛋白主要参与肌肉运动，与钙离子或肌动蛋白结合，使ATP合成或水解，为肌肉运动供给能量；在肌球蛋白重链多态性方面值得注意的是Myosin-2 heavy chain是一种与肌动蛋白结合的蛋白，具有由肌动蛋白激活的ATP酶活性，是肌纤维的组成性蛋白。

图4 T检验树状图Fig.4 T test tree

3 讨 论

本研究对乌珠穆沁羊肉总蛋白鉴定，在1%假阳性条件下，共搜索到1003种蛋白质与18667种肽段。2017年Wang等[16]对猪背最长肌肉蛋白鉴定获得969个蛋白，4815个肽段， 应用本技术获得蛋白与iTRAQ技术一样稳定可靠。本研究筛选的上调蛋白共11个，其中7个是与肉品质相关的特征性蛋白，在代谢功能方面的蛋白：β氧化是脂肪代谢的一个重要途径，而肌内脂肪的沉积又是影响肉品质的一个关键因素，例如fold change z中最高的蛋白Long-chain-fatty-acid-CoA ligase 1主要参与β氧化[17]，而Acyl-protein thioesterase 1直接参与脂肪代谢，众所周知肌内脂肪是影响肉品质的一个关键指标，而Long-chain-fatty-acid--CoA ligase 1和Acyl-protein thioesterase蛋白又与脂肪的代谢息息相关，所以这两个蛋白通过影响肌内脂肪的沉积而影响肌肉品质。蛋白质作为生理功能的执行者[18]，蛋白组的变化可能与肉嫩度相关[19]，Peptidyl-prolyl cis-trans isomerase NIMA-interacting 1蛋白其参与Ser/Thr-Pro修饰，并且在酪氨酸激酶的负调控中有至关重要的作用，丝氨酸、苏氨酸及酪氨酸是蛋白质的重要组成成分，氨基酸变化则影响蛋白质的变化，Peptidyl-prolyl cis-trans isomerase NIMA-interacting 1蛋白通过影响肌肉的嫩度从而影响肌肉品质。在收缩功能方面的蛋白，Parvalbumin alpha、30S ribosomal protein、Sarcoplasmic/endoplasmic reticulum calcium ATPase 3这些蛋白可以与两个钙离子或肌动蛋白结合，与钙离子共同作用于ATP，使ATP水解并释放能量，或使肌动蛋白具有激活ATP酶的能力。汪以真[20]研究显示:ⅡB 型肌纤维含量高的肌肉, 易发生PSE肉。I 和ⅡA 型肌纤维( 属于氧化型肌纤维)含量高的肌肉表现出更好的感官品质。脂肪更易在这种类型的肌纤维肌肉中沉积, 并且因其含有较多的肌红蛋白, 决定其肉质更好。更有研究显示红肌纤维收缩速度较慢，而白肌纤维收缩速度快，若红肌纤维含量高白肌纤维含量低则肉质鲜美[21-22]，Parvalbumin alpha、30S ribosomal protein、Sarcoplasmic/endoplasmic reticulum calcium ATPase 3蛋白作为在背最长肌肉中上调的蛋白若参与ⅡA肌纤维运动，则其红肌纤维含量高，肌内脂肪沉积更多，则决定其肉质更为鲜美； Myosin-2 heavy chain蛋白，是肌球蛋白重链异构体，而肌原纤维由肌球蛋白和肌动蛋白组成，肌球蛋白又由肌球蛋白重链、肌球蛋白轻链及两个亚基组成[23-24], Stephen[25]研究显示不同肌球蛋白重链会组成不同肌纤维类型，故Myosin-2 heavy chain蛋白直接影响肌纤维组成，最终决定肌肉品质。

4 结 论

1%假阳性条件下，检测到1003种蛋白质与18667种肽段。选取差异系数大于2或小于0.05作为选取差异蛋白的阈值，差异显著上调的蛋白有11个，下调为51个。上调的11个蛋白质在UniPort数据库中检索并分析，发现相较于臀部肌肉，背最长肌中有7个基因均与肌肉品质相关，并成功鉴定到决定肉品质的蛋白Myosin-2 heavy chain。