新疆塔什库尔干牦牛mtDNA Cytb基因和D-Loop区遗传多样性及系统进化分析

胡 丹，钟金城*，柴志欣

(1.青藏高原动物遗传资源保护与利用教育部重点实验室，西南民族大学 成都 610041；2.西南民族大学 青藏高原研究院，成都610041)

细胞色素b基因(Cytb)是哺乳动物线粒体DNA(mtDNA)上一个重要的功能基因，编码线粒体氧化磷酸化复合体III蛋白质，该蛋白质由379个氨基酸组成[1]，因其基因功能限制，具有较强的保守性，插入和缺失的变异很少出现在Cytb基因中，大多数碱基置换集中在转换和颠换两种情况，因而Cytb基因经常被作为分析物种间遗传进化关系的重要标记[2]，是最为理想的线粒体DNA遗传标记之一[3-5]。近年来基于mtDNA的基因研究被广泛应用于牦牛这一特殊物种上，姬秋梅等[6]通过对西藏牦牛Cytb基因的测序研究，系统阐述了西藏众多牦牛类群的进化地位和种内遗传多样性；Cytb基因还被用于种间起源的研究当中，李齐发等[7]通过对野牦牛和家牦牛这两个亲缘关系较近的物种的线粒体基因研究，证实了家牦牛与野牦牛在遗传进化关系上是由同一祖先进化而来的观点；涂世英等[8]对中甸牦牛Cytb基因进行了测序，进一步证实了牦牛不同类群间存在巨大的基因多态性差异。而mtDNA中的D-loop区与Cytb不同，其进化速度快，变异较大，适用于对亚科内属、种间的系统学研究，郭松长等[9]通过D-loop区部分序列的变异，对我国10个家牦牛品种间的遗传多样性、聚类关系进行了分析；张成福等[10]对西藏牦牛的D-loop区序列进行了测序，对其众多类群的进化分类进行了不同角度的论证；汪琦等[11]测定了三江黄牛D-loop区部分序列对三江黄牛这一重要经济品种的系统进化地位进行了阐述。

塔什库尔干牦牛主要分布于我国新疆塔里木盆地西部、帕米尔高原东部、青藏高原北部边缘及塔吉克斯坦东北部海拔2 900～4 700 m的高寒草原草场及高寒草甸草场，属役、肉、乳、毛皮兼用型的原始地方牦牛类群[12-15]，体格粗壮结实，毛色以黑、灰居多，对环境适应性强、抗逆性好，是新疆帕米尔高原高寒地区农牧民赖以生存的重要畜种[5]。本研究测定了10个塔什库尔干牦牛个体的Cytb基因和D-loop区序列，通过克隆测序探讨了新疆西部高海拔地区这一新的牦牛类群的遗传多样性和mtDNA分子进化关系，为塔什库尔干牦牛这一独特遗传资源的进一步保护与开发利用提供相应的理论基础。

1 材料与方法

1.1 样品采集

在新疆自治区塔什库尔干自治县塔合曼乡采集健康成年牦牛耳组织样品10个(75°54'12"E,32°0′36′′N，数据来源于国家基础地理信息中心，http://ngcc.sbsm.gov.cn/)。耳样于75%乙醇溶液中保存带回实验室-20 ℃低温保存备用。

1.2 总DNA提取、引物合成与PCR扩增

使用动物组织基因组DNA提取试剂盒(TianGen)，提取牦牛耳样DNA后产物分别进行琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测 DNA浓度和质量。

参考涂世英等[8]、杨万远等[16]对中甸牦牛和野牦牛Cytb基因设计的引物，其中F:5'-GTTCCGTAGCCATAGCCG-3'，R:5'-TTGAGTCTTAGGGAGGTT-3'，对塔什库尔干牦牛细胞色素b基因进行扩增；参考郭松长等[9]对家牦牛D-loop区序列设计的引物，其中F:5'-CTGCAGTCTCACCATCAACC-3'，R:5'-GGGGTGTAGATGCTTGC-3'，对D-loop区序列进行扩增。总PCR反应体系为25 μL，其中，上下游引物均为1 μL，模板DNA为1 μL，2×long Taq DNA预混酶12.5 μL，灭菌ddH2O 9.5 μL。PCR反应条件为：94 ℃预变性3.5 min；94 ℃变性45s；54 ℃退火50 s；72 ℃延伸1 min，35个循环；最后72 ℃延伸8 min，4 ℃保存。

1.3 基因克隆及测序

PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测目的片段大小后进行胶回收，用DNA纯化试剂盒分离纯化后连接在PMD19-T载体上，将重组质粒转化到高敏感度感受态细胞DH5中，再涂于LB平板(20g/L X-Gal,10g/L IPTG,10g/L Amp)上培养12 h后，挑取单一白色菌落接种在LB(10g/L Amp)液体培养基上震荡培养8 h，重组质粒进行菌液PCR后由英潍捷基(上海)生物技术有限公司测序[11]。

1.4 对比序列来源

从Genebank获得的牛亚科代表物种以及绵羊作为外群体的序列来源见表1。

表1 牛亚科代表性牛种及外类群序列来源Table 1 The source of sequences in part of Bovinae varieties and outgroup

1.5 数据处理

使用DNAMAN软件对测序结果进行编辑整理；再使用clustalX1.83软件对同源序列进行比较；使用DNAsp5.0软件统计塔什库尔干牦牛核苷酸多样性(Nucleotide diversity)、单倍型多样度(Haplotype diversity)和核苷酸单倍型数(Number of Haplotypes)，之后对突变位点进行Tajima's D中性检验；使用MEGA5.0软件，自举分析(Bootstrap)采用1000次重复抽样，按照Kimura-Two-Parameter模型计算遗传距离，NJ(Neighbor Joining Method)法构建进化树。

2 结 果

2.1 Cytb基因与D-loop区PCR扩增

在普通牛mtDNA序列(Genebank Accession No.V00654)中，细胞色素b长度为1 140 bp，塔什库尔干牦牛PCR扩增结果长度为1 650 bp左右(图1)，与参考序列比对后，完全比对上的序列长度为1 140 bp，扩增出Cytb基因。参考普通牛mtDNA全序列得知D-loop区序列长度为898 bp，塔什库尔干牦牛PCR扩增结果长度为 920 bp，将测序得到的序列与参考序列比对，完全比对上的长度在 890～910 bp之间，扩增出D-loop区序列。

2.2 塔什库尔干牦牛mtDNA Cytb基因、D-loop区序列的遗传多样性

2.2.1 碱基序列组成 塔什库尔干牦牛Cytb基因的全序列长度为1 140 bp，个体间序列长度无差异；T、A、G、C的含量分别为27.72%、33.21%、12.92%、26.15%；A+T含量为60.93%；G+C含量为39.07%，具有明显的碱基偏好性。D-loop区序列全长在890～910 bp之间，不同个体间存在序列长度差异；4种核苷酸T、A、G、C的平均比例分别为26.12%、34.22%、25.27%、14.39%，；A+T含量为60.34%；G+C含量为39.66%，同样存在明显的碱基偏好性。

2.2.2Cytb基因和D-loop区序列的多态性 使用 DNAsp软件计算塔什库尔干牦牛Cytb基因序列的核苷酸多样性(Nucleotide diversity)和单倍型多样性(Hd)，发现3个SNP位点，全部为转换，符合Cytb基因保守的特征；核苷酸多样性(Pi)为0.00205，单倍型数(H)为3，其中Ta3～Ta10号样本为一个单倍型， Ta2、Ta11号样本各自为一个单倍型 (表2)，单倍型多样性(Hd)为0.378；塔什库尔干牦牛Cytb基因在581～1 026 bp之间有1个保守区域，在该保守区域内，A、T含量为58.1%；Tajima为-0.21 206，中性检验结果不显著(P>0.10)。D-Loop区共统计出36个SNP位点，其中转换11个，颠换21个，缺失3个，其核苷酸多样性(Pi)为0.00 839，分析得到的单倍型数(H)为6，单倍型多样性(Hd)为0.778，Tajima为-1.66 098，中性检验结果不显著(P>0.05)。

2.3 遗传距离及系统进化分析

选取美洲野牛、西藏牦牛等牛亚科代表性牛种及测序得到的塔什库尔干牦牛，共15个牛种，以绵羊作为外类群用邻接法(NJ)构建系统发育树(图2)。结果显示塔什库尔干牦牛首先与青海牦牛、巴州牦牛聚为一类，接着和西藏牦牛、野牦牛聚在一起，紧接着与美洲野牛聚在一起，普通牛、欧洲野牛和大额牛聚在一起后与牦牛一支聚在一起，而印度野牛与爪哇牛介于这两支之间，牛亚科最外侧为非洲水牛和亚洲水牛，犀牛、白犀牛、绵羊独立于牛亚科物种之外。基于Cytb基因的牛亚种间遗传距离见表3。由表3知，塔什库尔干牦牛和巴州牦牛的遗传距离最近为0.00115，其次是青海牦牛、西藏牦牛和野牦牛，分别为0.00345、0.00692和0.00808，最远的是犀牛0.23185，牛种间距离最远的是白犀牛和瓜哇牛，为0.24078。

选取麦洼牦牛、大通牦牛等牛亚科代表性牛种及测序得到的塔什库尔干牦牛共14个牛种，同样以绵羊作为外群体，NJ法构建系统进化树(图3)。在进化树中，塔什库尔干牦牛首先与麦洼牦牛和大通牦牛聚在一起，并与青海牦牛、巴州牦牛聚为一类，之后再与西藏牦牛和野牦牛聚为一类，之后和美洲野牛、欧洲野牛聚在一起，牛亚种群体中最外侧为亚洲水牛，最后与绵羊聚在一起。基于D-loop区的牛亚种间遗传距离见表4。由表4知，塔什库尔干牦牛和麦洼牦牛的遗传距离最近为0.00 148，其次是大通牦牛、巴州牦牛和青海牦牛，分别为0.00 471、0.00 994和0.00 808，最远的是亚洲水牛0.15 199，牛种间距离最远的是亚洲水牛和普通牛，为0.16 466。

表4 牛亚科不同物种间Kimura双参数遗传距离(D-loop)Table 4 Kimura 2-parameter genetic distance among species in Bovinae(D-loop)

3 讨 论

本研究首次以塔什库尔干牦牛线粒体基因为研究对象，测定了塔什库尔干牦牛10个个体的Cytb基因与D-loop区全序列，对塔什库尔干牦牛的遗传多样性与系统进化地位做出了进一步分析。经测定，Cytb基因序列总长度为1 140 bp，发现3个多态位点且变异类型全部为转换，符合Cytb基因保守的特点； A、T、G、C四种碱基的含量百分比分别为27.72%、33.21%、12.92%、26.15%，表现出一定碱基偏好性；单倍型的多样性为0.2 571，核苷酸多样性为0.00 035。 D-loop区序列长度在不同个体间存在差异，长度在890～910 bp之间，4种核苷酸T、A、G、C的平均比例分别为26.12%、34.22%、25.27%、14.39%，同样表现出一定的碱基偏好性。与Cytb基因不同的是，D-loop区进化速度快，变异较大的特性在本研究中也有所体现：本研究共统计出D-loop区序列中存在36个SNP位点，其中转换11个，颠换21个，缺失3个，符合D-loop区序列的特征，也与汪琦等[11]对中甸牦牛D-loop区的研究结果相似；其单倍型多样性(Hd)为0.778，核苷酸多样性(Pi)为0.00 839，高于汪琦等[11]报道的中甸牦牛结果，表明塔什库尔干牦牛种内具有丰富的遗传多样性，其群体变异也在中国地方牦牛类群中处于较高水平，同时，较高的单倍性多样性及不均匀的核酸变异类型，说明塔什库尔干牦牛群体内存在两种母系起源的可能性较大，这也与家牦牛具有两种母系起源的研究结果吻合[11，17]。

图2 NJ法构建牛亚科系统发育树(Cytb)Fig. 2 Neighborjoining tree reconstructed in Bovinae(Cytb)

图3 NJ法构建牛亚科系统发育树(D-loop)Fig. 3 Neighborjoining tree reconstructed in Bovinae(D-loop)

本研究基于Cytb基因的牛亚科系统聚类分析得出，塔什库尔干牦牛与巴州牦牛、青海牦牛聚为一类，接着与西藏牦牛和野牦牛聚为一类，表明塔什库尔干牦牛与巴州牦牛和青海牦牛亲缘关系近，原因可能与塔什库尔干牦牛和巴州牦牛在地理位置上较近，使得其基因交流的机会大大增加，也与其生存环境相似有关，而大部分巴州牦牛、青海牦牛与野牦牛亲缘关系较近，与近年来人为育种改良存在必然联系。在基于D-loop区序列的牛亚科系统聚类分析中，塔什库尔干牦牛首先与麦洼牦牛和大通牦牛聚在一起，并与青海牦牛、巴州牦牛聚为一类，之后再与西藏牦牛和野牦牛聚为一类，与Cytb基因中与青海牦牛和巴州牦牛亲缘关系近的推论不同的是，虽属于同一分支，但塔什库尔干牦牛与麦洼牦牛和青海大通牦牛的遗传距离更近，之后才与巴州牦牛和青海牦牛聚在一起，这一结果也与D-loop区序列变异速度较快，样本数量少有关，但也进一步说明了塔什库尔干牦牛种内遗传多样性的丰富性。Cytb基因与D-loop区的聚类分析同时表明西藏牦牛与野牦牛单独聚为一类，和其他牦牛类群分开，也符合现有的家牦牛与野牦牛是同一祖先原始牦牛后代的起源观点[18-24]，塔什库尔干牦牛在与巴州牦牛、青海牦牛和西藏牦牛的系统进化分析中表现出丰富的遗传多样性，进一步说明了这一新的牦牛类群在家畜遗传资源的发掘过程中具有十分重要的现实意义。

4 结 论

本研究首次对塔什库尔干牦牛10个个体的Cytb基因与D-loop区序列进行了完整的克隆测序分析，对其系统进化地位做出了阐述。塔什库尔干牦牛具有作为我国地方优良地方牦牛品种的遗传资源潜质，是宝贵的牦牛遗传资源，其群体变异程度高，遗传多样性较为丰富，该结果可为塔什库尔干牦牛遗传资源的进一步保护与利用提供理论基础。