钩吻素己在大鼠体内的毒物动力学和组织分布研究

2018-12-05姬圣洁沈保华

中国司法鉴定 2018年6期

姬圣洁，沈保华，刘伟

（1.司法鉴定科学研究院上海市法医学重点实验室上海市司法鉴定专业技术服务平台，上海200063；2.复旦大学基础医学院法医系，上海 200032）

钩吻（Gelsemium elegans Benth.）别名胡蔓草、断肠草、大茶药、毒根等，是马钱科胡蔓藤属植物胡蔓藤的全株。在民间，钩吻以外用为主，具有祛风、杀虫止痒、消肿拔毒的疗效。近年来，发现钩吻还具有抗肿瘤[1-5]、抗焦虑[6]、消炎止痛[6-8]、免疫调节、散瞳[9]等功效。钩吻素己（gelsenicine）是杜秀宝等人[10]首次从国产钩吻中提取、分离并测定结构的生物碱，化学结构式如图1。高明雅等[3]的研究表明钩吻中三种生物碱单体钩吻素子、钩吻素甲和钩吻素己都显示出对肝癌细胞HepG2的增殖抑制活性，其中钩吻素己的效果最好。刘明等[9]发现钩吻素己能减轻大鼠的神经性疼痛和炎症性疼痛。而小鼠腹腔注射钩吻素己的毒性研究显示，其半数致死量（LD50）为0.165mg/kg，是目前为止国产钩吻中毒性最大的生物碱[11]。由于钩吻是剧毒植物，其治疗量和中毒量相近，治疗过程中发生中毒导致呼吸停止的案例已有报导，因使用不当、自杀或者恶意投毒等原因造成钩吻中毒的事件也时有发生[12-14]，且有关钩吻素己在生物样品中检测的方法学，动物染毒后的动力学、体内组织分布情况以及排泄方面的研究未见文献报道。因此本研究以钩吻素己为研究对象，采用单次灌胃染毒法建立大鼠急性中毒模型，探讨其在大鼠体内的毒物动力学、组织分布以及排泄情况，为钩吻中毒案件中法医学鉴定的取材及毒理学研究的开展提供参考和依据。

图1 钩吻素己的化学结构

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

AcquityTM Ultra Performance LC超高效液相色谱仪（美国Waters公司）；API 4000Q trap四极杆-线性离子阱质谱仪（美国AB SCIEX公司）；HR2860 Cucina搅拌机（荷兰皇家飞利浦电子公司）；MD200-2氮气吹扫仪（杭州奥盛仪器有限公司）；Centrifuge 5810R冷冻离心机（德国Eppendorf公司）；TDZ4-WS离心机（上海卢湘仪离心机有限公司）；XW-80A旋涡混合器（上海医科大学仪器厂）；BSA 124S电子天平（赛多利斯科学仪器有限公司）；Milli-Q超纯水系统（美国Millipore公司）。

钩吻素己对照品（纯度99.53%）（成都曼思特生物科技有限公司）；士的宁对照品（以97%计）（中国药品生物制品检定所）。

甲醇、乙腈、乙酸铵（纯度≥99.0%）、50%甲酸溶液均为HPLC级（美国Fluka公司）；氢氧化钠（NaOH）、乙酸乙酯均为分析纯（上海凌峰化学试剂有限公司）；羧甲基纤维素钠（CMC-Na）为化学纯（国药集团化学试剂有限公司）；超纯水由Milli-Q超纯水系统制得。

空白血液（经肝素抗凝）、空白尿液和空白组织来自未经钩吻素己染毒的大鼠。

1.2 溶液配制

钩吻素己混悬液：量取超纯水150mL置于500mL烧杯中，将称取的1.0g CMC-Na粉末均匀撒在水面上，密封超声2 h，待完全溶解后再加入50 mL超纯水，继续密封超声0.5 h，即配制成0.5%的CMC-Na溶液，加入适量钩吻素己对照品配制成一定浓度的钩吻素己混悬液。

复溶溶液：V（甲醇）∶V［20mmol/L乙酸铵（含0.1%甲酸和5%乙腈）缓冲溶液］=70∶30。

1.3 实验动物

健康清洁级SD大鼠56只，雌雄各半，体重230±30 g［（上海斯莱克实验动物有限责任公司），实验动物生产许可证号为SCXK（沪）2012-0002，使用许可证号为SYXK（沪）2012-0002］。本研究所进行的动物实验符合本院伦理委员会的伦理标准，可以进行大鼠动物实验。

1.4 方法

1.4.1 仪器条件

色谱条件：色谱柱为ZORBAX SB-C18柱（150×2.1mm，5μm）（美国安捷伦公司），柱温为室温，前接ZORBAX-Extend-C18保护柱；流动相包括A:20 mmol/L乙酸铵缓冲溶液（含0.1%甲酸和5%乙腈），B:甲醇，流速为 0.2 mL/min，梯度洗脱程序为：0~0.5min10%B，0.5~0.6min10%~40%B，0.6~1.5min 40%B，1.5~1.6 min 40%~70%B，1.6~5.5 min 70%B，5.5~5.6 min 70%~10%B，5.6~8.0 min 10%B；进样量为 5 μL。

质谱条件：电喷雾离子源-正离子模式（ESI+），多反应监测（MRM），离子源电压（IS）5500 V，离子源温度（TEM）500 ℃，气帘气（CUR）30 psi，雾化气（GS1）40 psi，辅助气（GS2）50 psi。化合物的两对母离子/子离子对起定性的作用，第一对离子对用于定量分析。优化的质谱参数见表1。

表1 钩吻素己和士的宁的质谱参数

1.4.2 动物分组、染毒与取材

通过钩吻素己单次灌胃染毒法建立大鼠中毒模型，给药前12 h禁食、自由饮水。试验主要分为3组：毒物动力学组、组织分布组和排泄组。

毒物动力学组：预试验结果表明，钩吻素己的毒性作用在大鼠体内具有明显的性别差异，雄性大鼠的耐受性相对更强，因此在毒物动力学试验设计中雌雄大鼠的给药剂量有所不同。取健康SD大鼠24只，雌雄各半。雌性大鼠随机分为低、中、高3个剂量组，每组4只，钩吻素己的灌胃剂量分别为0.1、0.2、0.4 mg/kg；雄性大鼠随机分为低、中、高 3个剂量组，每组 4 只，灌胃剂量分别为 0.4、0.8、1.5mg/kg。给药体积控制在在1~3 mL，于给药前及给药后2、5、10、20、30、45、60、120、180、240、360、480 min 从大鼠眼眶静脉取血，每个时间点采血约300 μL，置于含肝素的抗凝管中，分析检测前置于-20℃冰箱中保存。

组织分布组：取健康SD大鼠24只，随机分为3组，每组8只，雌雄各半，每只灌胃0.4 mg/kg的钩吻素己，分别于给药后5、15、60 min时处死一组大鼠（4雌4雄），并立即解剖取出心、肺、脾、肝、肾、胰、脑、骨骼肌、胃、小肠、生殖器（雄性：睾丸，雌性：子宫）共11种组织。用剪刀剪开胃和小肠，去除内容物并用生理盐水冲洗干净，其余组织用生理盐水快速冲洗表面，放在滤纸上吸干，然后置于-20℃冰箱中保存。用生理盐水清洗的目的是去除组织表面的血迹，确保实验结果的准确性。

排泄组：取健康SD大鼠8只，雌雄各半，放入代谢笼中收集空白尿液和粪便。然后灌胃给予大鼠0.4 mg/kg的钩吻素己，置于代谢笼中收集24 h内的尿液和粪便，并测量每只大鼠的尿液体积和粪便质量。排泄物冷冻保存，待检。

1.4.3 样品前处理

取血液或尿液样品0.5mL，加入2μg/mL士的宁工作液10μL、1%NaOH溶液50μL，涡旋混合1min（混合物pH值约为8.2），再加入乙酸乙酯3 mL萃取，涡旋2 min后，以离心半径12 cm，3 000 r/min离心3min。取上清液于50℃氮吹仪上吹干，残留物中加入复溶溶液100μL，混匀后供LC-MS/MS分析。

将生物组织剪碎并研磨成匀浆，称取组织匀浆0.5 g，加入 2 μg/mL 士的宁工作液 10 μL、1%NaOH溶液 800 μL，涡旋混合 1 min（混合物 pH≈9），再加入乙酸乙酯3 mL萃取，涡旋3 min后，以离心半径12 cm，3 000 r/min离心3 min。取上清液置于50℃氮吹仪上吹干，残留物中加入复溶溶液200 μL，涡旋均匀后转移至1.5 mL离心管中，于-20℃冰箱中放置30 min，4℃下以离心半径9.5 cm，13 000 r/min离心2 min，取上清液供LC-MS/MS分析。

2 结果与讨论

2.1 LC-MS/MS法测定生物检材中钩吻素己含量的方法学确认

本研究前期笔者已建立了测定生物检材（血液、尿液、肝组织）中钩吻素己含量的LC-MS/MS法，并进行了全面的方法学验证[15]。结果表明钩吻素己在 0.05~30 ng/mL（0.05~30 ng/g）范围内线性良好，检出限为 0.01 ng/mL（0.01 ng/g），提取回收率为67.55%~114.59%，准确度在99.00%~114.33%之间，日内、日间精密度均不超过7.48%，符合生物样品定量检测的要求。

2.2 给药剂量的选择

钩吻素己是国产钩吻中毒性最大的生物碱，小鼠腹腔注射的LD50为0.165 mg/kg[11]。以此为基础，本研究通过预试验考察了单次灌胃 4.0、2.0、1.5、1.0、0.4、0.2、0.1 mg/kg 钩吻素己后雌雄大鼠的症状表现。选择给药剂量时需保证高、中、低三个剂量组大鼠呈现不同程度的中毒症状，且在整个采血时间段内未出现死亡。此外，钩吻素己对大鼠毒性作用有明显的性别差异，相同给药剂量下雄性大鼠的中毒症状较轻，且致死剂量比雌性高，因此本研究对雌、雄性大鼠的给药剂量不完全一致。根据预试验结果，雌性大鼠高、中、低剂量分别选择 0.4、0.2、0.1 mg/kg，雄性大鼠分别选择 1.5、0.8、0.4mg/kg，以研究钩吻素己在雌雄大鼠体内的毒物动力学差异；灌胃给予相同剂量0.4 mg/kg钩吻素己，目的是更加直观地比较钩吻素己在雌雄大鼠体内的组织分布差异和排泄差异。

2.3 钩吻素己灌胃给药后大鼠的中毒症状

大鼠给予钩吻素己灌胃给药后，高、中剂量组大鼠（雄性大鼠给药剂量分别为1.5、0.8 mg/kg，雌性大鼠给药剂量分别为0.4、0.2 mg/kg）在染毒后10 min头部开始发抖、四肢无力、叩牙，约15 min时出现头腹贴地、叩牙频繁、全身痉挛、呼吸困难等症状，约30 min后痉挛症状减轻，但四肢仍然无力，45 min左右中毒症状基本消失，逐渐恢复到正常状态；低剂量组大鼠（雄性大鼠给药剂量为0.4 mg/kg，雌性大鼠为0.1 mg/kg）在给药10 min左右出现少动、头部发抖症状，而后逐渐恢复正常。同等给药剂量时雌性大鼠中毒症状更加明显。

2.4 钩吻素己灌胃给药后在大鼠体内的毒物动力学

雌性、雄性大鼠经钩吻素己单次灌胃染毒后，各剂量组的平均血药浓度-时间曲线见图2～3。通过药物动力学数据处理软件PKSolver2.0，采用非房室模型对钩吻素己的血药浓度-时间数据进行拟合分析，计算出的主要毒物动力学参数见表2～3。大鼠灌胃染毒后约10~20min，钩吻素己血药浓度达到峰值。雌性大鼠单次灌胃0.1、0.2 mg/kg钩吻素己时，消除半衰期（t1/2）分别为 72.09、89.60 min，说明其在体内保留时间短、代谢速度快，而给药剂量增大至0.4mg/kg时，t1/2为 162.60 min，与 0.1、0.2 mg/kg剂量组相比，t1/2明显延长，且药时曲线下面积与给药剂量不成正比，说明在0.4 mg/kg给药剂量下，钩吻素己在雌性大鼠体内呈非线性动力学。雄性大鼠也出现了类似的情况，在0.4、0.8 mg/kg钩吻素己的给药剂量下呈线性动力学，在1.5 mg/kg给药剂量下呈非线性动力学。这可能是由于钩吻素己与血浆/组织蛋白质发生了结合，或者给药剂量超过了一定限度，与代谢有关的酶的催化能力和载体的转运能力达到了饱和，从而引起了非线性动力学过程。

另外，钩吻素己的代谢在大鼠体内具有明显的性别差异。灌胃给药相同剂量，即0.4mg/kg钩吻素己时，雌性大鼠峰浓度为8.56 ng/mL，药时曲线下面积为 931.27（ng/mL）·min，半衰期为 162.60min，清除率为 0.40 L/（kg·min），雄性大鼠峰浓度为2.79ng/mL，药时曲线下面积为 180.51（ng/mL）·min，半衰期为77.12 min，清除率为 4.16L/（kg·min），表明钩吻素己在雌性大鼠体内的暴露程度大于雄性，而代谢活性却相对较弱。

图2 雌性大鼠单次灌胃0.1、0.2、0.4 mg/kg钩吻素己平均血药浓度-时间曲线

图3 雄性大鼠单次灌胃0.4、0.8、1.5mg/kg钩吻素己平均血药浓度-时间曲线

表2 雌性大鼠单次灌胃0.1、0.2、0.4 mg/kg钩吻素己的毒物动力学参数（n=4）

表3 雄性大鼠单次灌胃0.4、0.8、1.5 mg/kg钩吻素己的毒物动力学参数（n=4）

2.5 钩吻素己灌胃给药后在大鼠体内的组织分布

大鼠单次灌胃0.4 mg/kg钩吻素己，选择给药后5、15、60 min三个时间点取材，所测得的组织浓度分别代表吸收相、平衡相和消除相的药物分布，各组织中待测物的浓度见图4～7。钩吻素己在大鼠体内分布迅速而广泛，在心、肺、脾、肝、肾、胰、脑、骨骼肌、胃、小肠、生殖器（雄性：睾丸，雌性：子宫）均有不同程度的分布。从组织浓度随时间的变化趋势上来看，小肠、肝、胰在给药后5 min达到最大浓度，而后随时间的推移开始下降，这可能与灌胃的给药方式有关，小肠是主要的吸收器官，巨大的内表面积提高了吸收效率，肝和胰是重要的消化器官，肝脏还有代谢的作用，因此给药后短时间内的组织浓度较高，随着消化和代谢过程的进行浓度下降；而其他组织在给药后15 min时浓度最高，60 min时明显下降。

从同一取材时间点不同组织的浓度差异上来看，钩吻素己在雌性大鼠的小肠、胃、肝、胰中含量较高，其次是肾、肺、脾、子宫，在心、脑、骨骼肌中含量较低，雄性大鼠的组织分布与雌性大体一致，但生殖器官中的含量稍有不同，在小肠、胃、肝、胰中含量较高，其次是肾、肺、脾，在心、脑、骨骼肌、睾丸中含量较低。肝和胰中钩吻素己的含量仅次于小肠和胃，但高于其他组织，因此在遇到此类中毒案件时，可优先选择肝和胰作为送检材料进行毒物分析。

从性别差异上来看，给予雌雄大鼠相同灌胃剂量，在相同组织中钩吻素己的含量不同，给药后各时间点雌性大鼠的组织浓度普遍高于雄性，大约是其组织浓度的2～5倍，再次证明钩吻素己在雌性大鼠体内暴露量较大。性别差异可能是由于性激素通过调节钩吻素己相关代谢酶的水平影响了其代谢过程或细胞色素P450酶介导的代谢过程有差异[16-17]，但具体机理还需要进一步深入研究。

图4 雌性大鼠单次灌胃0.4mg/kg钩吻素己组织浓度（n=4）

图5 雌性大鼠单次灌胃0.4mg/kg钩吻素己组织浓度（n=4）

图6 雄性大鼠单次灌胃0.4mg/kg钩吻素己组织浓度（n=4）

图7 雄性大鼠单次灌胃0.4mg/kg钩吻素己组织浓度（n=4）

2.6 钩吻素己灌胃给药后随尿液和粪便的排泄情况

大鼠单次灌胃0.4 mg/kg钩吻素己后，收集24 h内的尿液和粪便，检测待测物的浓度，从而获得钩吻素己通过尿液和粪便的排泄情况，结果见表4～5。雌性大鼠尿液中原药排泄量占给药量的（0.179%±0.117%），粪便中原药排泄量占给药量的（0.00521%±0.00344%）；雄性大鼠尿液中原药排泄量占给药量的（0.0610%±0.0387%），粪便中原药排泄量占给药量的（0.00458%±0.00158%）。由此可知，大鼠灌胃给药后，钩吻素己通过尿液排泄的比例大于粪便排泄，雌性大鼠的尿液、粪便中原药排泄比例均大于雄性大鼠，但钩吻素己通过这两种途径的排泄量都非常有限。推测原药可能通过胆汁、汗液等其他途径排泄或者药物在体内转化为代谢物，因而以原型通过尿液和粪便排出的比例较低。