菏泽市2013～2017年手足口病病毒学监测分析

刘雅娟 刘启林

[摘要] 目的 探讨菏泽市2013～2017年手足口病流行病毒类型，为菏泽市手足口病疫情的防控和实施策略提供科学依据。 方法 2013～2017年菏泽市各县区手足口病定点医疗单位收集的临床诊断病例的粪便或肛拭子标本，提取病毒核酸，应用实时荧光定量PCR进行病毒的核酸检测；用描述性流行病学方法分析流行病学特征。 结果 2013～2017年共收集样本2751份，其中阳性样本2294份，阳性率为83.39%；EV71阳性样本1111份，阳性率为40.39%；CA16阳性样本387份，阳性率为14.08%；其他肠道病毒阳性样本796分，阳性率为28.93%。2013年、2015年优势株为EV71；2014年优势株为CA16；2016、2017年以其他肠道病毒型为优势株。不同年龄组、性别、季节分布差异有显著性（P<0.05）。各年手足口病毒型别分布差异有统计学意义（P<0.05）。 结论 2013～2017年菏泽市手足口病流行病毒类型从高到低分别是EV71、其他肠道病毒和CA16。EV71是引起重症病例的主要病原体。在高发季节前，应加强托幼机构及散居儿童的卫生健康教育和防控力度，提前做好低幼儿童的疫苗宣传及接种工作；强化手足口病监测力度。

[关键词] 手足口病；实时荧光定量PCR；肠道病毒71型（EV71）；柯萨奇病毒A16型（CA16）；核酸

[中图分类号] R446.5 [文献标识码] B [文章编号] 1673-9701（2018）22-0131-05

[Abstract] Objective To investigate the epidemic virus types of hand-foot-and-mouth disease（HFMD） in 2013-2017 in Heze to provide scientific evidence for the prevention and control and implementation strategy of the epidemic situation of HFMD in Heze. Methods Stool or specimens by means of a swab collected from regular medical organizations in every county and district of Heze from 2013 to 2017 were used to extract viral nucleic acid. Viral nucleic acid was tested using real-time fluorescence quantitative PCR. Epidemiological characteristics were analyzed using descriptive epidemiological method. Results 2751 specimens were collected from 2013 to 2017. Out of them， 2294（83.39%） were positive. 1111 （40.39%） were EV71-positive. 387 （14.08%） were CA16-positive. 796 （28.93%） were other-enterovirus positive. Dominant strain in 2013 and 2015 was EV71. Dominant strain in 2014 was CA16. Dominant strain in 2016 and 2017 was other enterovirus. The differences among subgroups of age， sex and season were significant （P<0.05）. The distributions of HFMD virus types in every year were statistically different（P<0.05）. Conclusion The most common HFMD virus type in Heze from 2013 to 2017 was EV71， followed by other enterovirus and CA16. EV71 was the main pathogen which caused severe cases. Before the high-occurrence season， the health education and prevention and control in nurseries and scattered children should be enhanced. The promotion of vaccines and vaccination in young children should be done previously. It is necessary to strengthen the monitoring of HFMD.

[Key words] Hand-foot-and-mouth disease； Real-time fluorescence quantitative PCR； Enterovirus 17 （EV71）； Coxsackie virus A16 （CA16）； Nucleic acid

手足口病（hand-foot-and-mouth disease，HFMD）是一種由多种肠道病毒引起的传染病[1]，以5岁以下婴幼儿的发病为主，可导致患儿发热及手、足等身体多部位出现疱疹，部分患儿甚至会出现严重的并发症，如心肌炎、神经源性肺水肿等重症，严重者可导致死亡[2]。在我国，手足口病的流行病原在2O世纪80年代前后以CA16病毒感染为主，90年代EV71病毒感染逐渐占主导地位[3]。2013年开始全国手足口病的病原出现以其他肠道病毒为主的现象[4]。为了进一步了解菏泽市手足口病的病毒型别，现收集，整理并分析2013～2017年菏泽市九个县区手足口病诊疗定点单位共计2751例临床诊断病例标本的病毒核酸检测结果，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料来源

根据《手足口病预防控制指南（2009版）》[5]中病原学监测要求，菏泽市各县（区）疾控工作人员到手足口定点诊疗单位采集临床诊断为手足口病的病例粪便或肛拭子，以卫生部2010版《手足口病诊疗指南》为手足口病例的临床诊断标准[6]。每县（区）每月最少需采集5例首次就诊的普通病例标本，当月县（区）病例总数少于5例时全部采样。所有重症和死亡病例均需采样。2013～2017年菏泽市九县区共采集手足口临床病例粪便或肛拭子标本2751份。

1.2 方法

1.2.1 标本采集及处理 按照《手足口病预防控制指南（2009版）中病原学监测要求，采集手足口病病例粪便或肛拭子标本，低温保存并送检。粪便标本取5 g加入含10%氯仿和玻璃珠的PBS提取液的离心管中，剧烈震荡30 min，4℃ 3000 rpm离心30 min，取上清液待检；肛拭子标本剧烈震荡10 min后，弃去棉拭子，4℃ 3000 rpm离心30 min，取上清液待检。处理完成的标本立即提取核酸或保存于-20℃。

1.2.2 仪器及试剂 Roche High Pure Viral RNA Kit提取试剂盒（瑞士Roche公司）；Enterovirus type71 real time RT-PCR kit，Coxsackievirus A16 real time RT-PCR kit荧光定量PCR试剂盒（中山达安基因股份有限公司）；实时荧光定量PCR仪（美国ABI，Step One Plus）。

1.2.3 病毒核酸检测 采用Roche High Pure Viral RNA Kit提取标本病毒核酸，取标本200 μL，加400 μL应用液混匀，室温10 min；混合液加入过滤管，下接收集管，10000 rpm 离心15 s，弃收集管，换新收集管；加500 μL 试剂Inhibitor Removal Buffer，8000 rpm 离心1 min，弃收集管，换新收集管；加450 μL试剂Wash Buffer，8000 rpm 离心1 min， 弃收集管，换新收集管；再加450 μL试剂Wash Buffer，8000 rpm离心1 min，弃收集管，换新收集管，最后12000 rpm离心10 s，弃收集管，换1.5 mL的EP管；加50 μL的试剂Elution Buffer，室温平衡1 min，用10000 rpm離心1 min，EP管中即为提取的RNA。Enterovirus type 71 real time RT-PCR kit、Coxsackievirus virus A16 real time RT-PCR kit荧光定量PCR试剂盒配制核酸反应扩增体系，使用实时荧光定量PCR仪检测。Real Time RT-PCR操作按试剂盒说明进行，反应如下：50℃ 15 min，1个循环；95℃ 15 min，1个循环；94℃ 15 s→55℃ 45 s（收集荧光），40个循环。反应结束后，呈典型S型扩增曲线且Ct值≤38，则判断为阳性；无典型S型扩增曲线或Ct值>38，则判断为阴性。

1.3 统计学方法

用Micrsoft Excel 2003创建数据表；用描述性流行病学方法对检测结果进行分析；用SPSS18.0软件进行统计学分析，定性资料用率表示，组间比较用χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 手足口病病毒学监测结果

通过实时荧光定量PCR对2013～2017采集的手足口病病例样本共2751份进行检测，结果阳性标本2294份，阳性率为83.39%（2294/2751）。其中，检出EV71、CA16、其他肠道病毒阳性分别为1111份、387份、其他肠道病毒阳性样本796份，阳性率分别为40.39%（1111/2751）、14.07%（3872751）、28.95%（796/2751）。从年份进行比较，2013年共检测样本575份，阳性样本499份，阳性率86.78%（499/575），病毒学监测结果由高到低依次为EV71（65.22%，375/575）、其他肠道病毒（20.17%，116/575）和CA16（1.39%，8/575），显示EV71为2013年优势病原体。2014年共检测样本533份，阳性样本430份，阳性率80.68%（430/533），病毒学监测结果由高到低依次为CA16（34.33%，183/533）、其他肠道病毒（23.45%，125/533）和EV71（22.89%，122/533），显示2014年CA16病毒在菏泽市有小范围暴发。2015年共检测样本580份，阳性样本502份，阳性率86.55%（502/580），病毒学监测结果为EV71（58.79%，341/580）、其他肠道病毒（26.38%，153/580）和CA16（1.38%，8/580），显示2015菏泽市手足口病继续以EV71为优势病原体。2016年共检测样本540份，阳性样本474例，阳性率（87.78%，474/540），病毒学监测结果由高到低依次为其他肠道病毒（39.07%，211/540）、CA16（29.81%，161/540）和EV71（18.89%，102/540）。2017年共检测样本526份，阳性样本389例，阳性率74.37%（389/526），病毒学监测结果由高到低依次为其他肠道病毒（36.52%，191/526）、EV71（32.70%，171/526 ）、CA16（5.16%，27/526）。显示2016、2017年其他肠道病毒是引起菏泽市手足口病的优势病原体。各年份手足口的阳性率有统计学差异（χ2=52.862，P<0.001）。引起手足口病的病毒型别分布有统计学差异（χ2=694.390，P=0.000）。见表1。

2.2 月份分布

将检测结果按发病月份分析，手足口病全年各月均有检出，1月、2月发病构成比较低，分别为2.98%（82/2751）、3.96%（109/2751），3月急增，发病构成比为10.8%（297/2751），4～6月为高峰期，4月构成比为13.7%（377/2751），5月构成比为15.09%（415/2751），6月构成比为10.18%（280/2751），7～12月呈缓慢下降趋势，发病构成比分别为6.87%（189/2751）、5.67%（156/2751）、4.47%（123/2751）、3.89%（107/2751）、3.56%（98/2751）、2.22%（61/2751）。见图1。

2.3 性别、年龄分布

男女阳性标本比例为1.86：1，男1491份，女803份，阳性标本在不同性别的分布差异有统计学意义（χ2=18.772，P=0.002）。从年龄结构上看，1～岁组和2～岁组标本阳性率分别为89.10%（875/982）和86.41%（763/883）。其他年龄组感染概率较低，由高到低依次为：3～岁组81.28%（304/374）、0～岁组73.25%（115/157）、4～岁组70.88%（129/182）、5～岁及以上组62.43%（108/173），差异有统计学意义（χ2=117.255，P=0.000）。

2.4 地区分布

从九县区手足口检测阳性率比较，不同县区差异有统计学意义（χ2=162.330，P=0.000）。鄄城阳性率最高，为93.11%（284/305），其次为定陶，阳性率为92.63%（289/312），最低的为曹县，阳性率为64.92%（198/305）；从各县区发病的病原型别来看，也存在统计学差异（χ2=90.802，P=0.000），牡丹区EV71构成比最高，为6.72%（185/2751）；成武县其他肠道病毒构成比最高，为4.03%（111/2751），定陶CA16构成比最高，为2.94%（81/2751），见表3、图2、图3。

2.5 重症病例检测结果

在62例重症患者（其中1例死亡）的标本中，55份检出手足口病毒，阳性率为88.71%（55/62）。其中，EV71病毒阳性率为82.26%（51/62）；其他肠道病毒阳性率为4.84%（3/62）；CA16病毒阳性率为1.61%（1/62）。2013年重症患者阳性15例，全部为EV71感染，阳性率为78.95%（15/19）；2014年重症患者阳性12例，EV71阳性9例，阳性率为69.23%（9/13）；2015年重症患者阳性22例，EV71阳性21例，阳性率为91.3%（21/22）；2016年无重症患者；2017年重症患者阳性6例，EV71阳性6例，阳性率为85.71%（6/7）。不同年份重症阳性率差异有统计学意义（χ2=16.677，P=0.001）。见表4。

3 讨论

通过对确诊样本的分析，结果表明2013～2017年菏泽市手足口病病毒优势株在不断发生变化，从阳性样本总量分析，EV71是引起菏泽市手足口的主要病毒型，2014年出现小规模的CA16的暴发，2016、2017这两年其他肠道病毒替代EV71成为优势病毒株，并且，由其他肠道病毒引起的手足口病病例构成比从2013年的23.2%（116/499），上升到2017年的49.01%（191/389），这与全国其他地市流行情况相类似：甘肃省2013～2016年手足口监测结果表明，除了2014年以CA16为优势病毒株，其余3年都是以其他肠道病毒为主，每年流行的其他肠道病毒型别都在变化，主要是CA6、CA10和CA4[7]；2011～2014年河北省手足口病病原构成，EV71和CA16感染所占比例总体上呈下降趋势，其他肠道病毒所占比例总体上呈上升的趋势[8]；2011～2015年广州市手足口病流行特征分析，同样在手足口的高发季节，EV71和CA16相比其他年份均出现下降，而其他肠道病毒所占比例呈现明显上升[9]。肠道病毒A组中的CA6、CA10引起手足口病例的报道逐年增多[10]。由此判断，其他肠道病毒可能成为未来引起菏泽市手足口病的优势病毒，因此在今后手足口病病原学监测中加大开展其他肠道病毒的分型鉴定的力度，有效提高我市手足口病的预防、控制能力。

菏泽市地处山东省西南部，中纬度地区，属暖热带季风气候。这种春季干燥多风，夏季高温多雨，冬寒夏热，春暖秋凉的气候特征，非常适宜肠道病毒等各种病原微生物的生长繁殖[11]，因而，菏泽市手足口病的發病高峰期均在春末夏初之际。3月初气温开始回升，3～6月的气温和空气湿度为手足口病的传播创造了适宜的环境，导致手足口病的高发[12]。提示，在高发的4～6月可尝试将气温、湿度、气压等可能导致的手足口病激增的气候条件作为预测的指标，同时加强本阶段的监测与防控，以防手足口病的暴发流行。

2013～2017年菏泽市2751例手足口病临床诊断病例，按照性别和年龄分组，发现男童组和女童组比例为1.86：1，性别分布有统计学差异，男童的发病率高于女童，这与男孩的好动及与人频繁接触相关[13]。1～岁组和2～岁组手足口病发病人数高于其他年龄组，可能与该年龄段儿童的免疫机制尚未发育完全有关，这与其他研究相同[14]。在病毒学检测方面，各县区引起手足口的病毒型别有统计学差异。牡丹区EV71构成比最高，成武县其他肠道病毒构成比最高，定陶县CA16构成比最高。各县区标本阳性率之间也有统计学差异，鄄城标本阳性率最高，其次定陶，曹县最低。各县区出现的差异可能存在多方面的影响因素，可能与各县区医疗卫生条件、人口免疫现状、病原体构成变化等有关。2013～2017年菏泽市手足口病重症病例主要由EV71引起，这与其他地市报道相一致[15]。这可能与EV71病毒感染性强，易引起神经毒性，引发重症[16]有关。

本研究为菏泽市针对性的开展手足口病的防治工作指明了方向，对未来手足口病病毒学流行趋势的预测提供了有效的实验室依据。同时，在未来的手足口病防治工作中应重点加强托幼机构、学校等人员流动性大且人口密集地区的手足口病卫生知识宣传，加大重点人群的防控力度，加大发病率高的县区的流调工作力度，在高发季节密切关注气候等影响条件的变化，及时开展应对工作，同时加强接种手足口疫苗的宣传工作，为适龄儿童接种手足口疫苗是预防手足口病最有效、最经济的手段。加强手足口病的病毒学监测力度，为手足口的預防与流行做好研判。

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（收稿日期：2018-03-27）