高位肛周脓肿患者负压封闭引流前后血清TGF-β、EGF水平变化及意义

王传思 ，谢贻祥，姚磊，黄鸿武，于庆生，王小龙，任龙，王永森，杨松

(1安徽医科大学附属六安医院，安徽六安237005；2安徽中医药大学第一附属医院)

高位肛周脓肿是指病灶位于肛提肌以上、距肛缘5～7 cm的脓肿，包括骨盆直肠间隙脓肿、直肠后间隙脓肿和高位肌间脓肿，其特点是脓肿范围大、侵犯位置深。手术是首选治疗方法，但因创面大而开放、排便持续污染等问题，创面愈合缓慢，治疗效果一般。研究表明，创伤修复过程复杂，参与调控的细胞因子众多，其中转化生长因子β(TGF-β)和表皮细胞生长因子(EGF)对成纤维细胞增殖起促进作用，能趋化炎性细胞于创面并聚合组织修复细胞，合成Ⅰ型前胶原、促进肉芽组织生长和后期组织的修复重建等[1]。近年来，我们曾试图从手术方法上改进以提高疗效[2,3]，创新性地将负压封闭引流(VSD)技术应用于高位肛周脓肿，发现临床效果明显改善[4,5]，但有关VSD对血清TGF-β和EGF影响的研究却少见报道。本研究观察了高位肛周脓肿患者VSD前后血清TGF-β和EGF水平变化，并探讨其意义。现报告如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2016年1月～2017年1月在安徽医科大学附属六安医院就诊的高位肛周脓肿患者。纳入标准：符合国家中医药管理局制定的高位肛周脓肿诊断标准的患者，年龄在18～65周岁；术前经腔内B超提示为高位脓肿，且术中确定脓肿侵至肛提肌以上；无明显手术禁忌证；通过医院伦理委员会审议批准，患者及家属同意并支持所有治疗方案且自愿接受临床观察研究，签署相应知情同意书。排除标准：不能配合治疗或患者自行要求退出实验者；实验过程发生不良事件性质严重者；提供信息不全、虚假者；内分泌性疾病患者。共收集患者40例，按随机数字表法分为两组各20例。观察组男15例、女5例；年龄(33.2±13.1)岁；脓腔面积(28.6±10.3)cm2；脓肿类型中直肠后深间隙4例、高位括约肌5例、肛提肌上3例、多间隙脓肿8例。对照组男14例、女6例；年龄(35.5±12.3)岁；脓腔面积(26.2±11.7)cm2；脓肿类型中直肠后深间隙3例、高位括约肌6例、肛提肌上2例、多间隙脓肿9例。两组年龄、性别、脓腔面积及脓肿类型比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。

1.2 手术及术后处理方法 观察组行VSD+内口封闭法[3]。具体操作：①探查：碘伏消毒术区并充分扩肛后行肛门指检，详细了解感染肛窦位置、内口位置、脓腔波及范围等；②脓腔切开：于波动明显处或主脓腔对应皮肤处作一长约3 cm的弧形切口，逐层进入脓腔，用组织钳探查其范围并排净脓液，避免损伤内外括约肌；③脓腔处理：以示指钝性分离腔内间隔，保证引流通畅，清创刮勺仔细清扫坏死组织，双氧水冲洗并彻底止血；④内口处理：小直角拉钩暴露脓腔内部，组织剪修剪内口周围坏死组织，可吸收线缝合封闭内口，干纱布蘸尽内口周围渗液，康派特胶加明胶海绵再次封堵内口；⑤放置VSD装置：根据创腔大小选择合适规格的医用泡沫敷料，将敷料适当裁剪并填至创腔，缝合固定后粘贴半透性薄膜，连接三通管后送至病房连接VSD负压装置；⑥术后处理：VSD持续吸引，根据引流液的颜色及量，适时增减生理盐水灌洗量，负压常规维持在125～300 mmHg，术后7～10 d更换1次VSD装置以防止肉芽生长。对照组行肛周脓肿传统低位切开高位挂线术。具体操作：①探查：碘伏消毒肛管并充分扩肛后行肛门指检，详细了解感染肛窦位置、内口位置、脓腔波及范围；②脓腔切开及挂线：在波动最明显处置放射切口，逐层进入脓腔后以探查出脓腔的范围并彻底排脓，自感染肛窦处探及内口，以探针从内口处挂入橡皮筋，逐层打开原脓腔切口与肛缘间的组织，橡皮筋跨过并结扎；③刮勺清扫脓腔内坏死组织，修剪创面为梭形(利于引流)，创面予以彻底止血，术毕创腔填以凡士林纱条引流，外以无菌纱布加压并包扎固定，送至病房；④术后处理：每天常规换药至创面愈合。术后两组均经外周静脉滴注予以头孢替安2 g/次，2次/d，持续5 d。治疗期间清淡、粗纤维饮食，保持大便通畅。

1.3 血清TGF-β、EGF检测方法 采用蛋白质免疫印迹法。分别在术前1 d及术后1 d、7 d，抽取两组静脉血10 mL，离心取血清，置-80 ℃冷冻保存。血清经裂解液处理后提取总蛋白[6]，每组取样本80 μg进行SDS-PAGE凝胶电泳，半干转移至PVDF膜；加入一抗(Abcam公司)、二抗(武汉博士德公司)后，洗涤并与发光试剂反应；曝光洗片并扫描胶片，用Image J软件计算各条带的灰度值，内参采用GAPDH(购自Santa Cruz公司)作为标准对照。每组重复测定3次。

2 结果

两组组内血清TGF-β、EGF术后1 d与术前1 d比较差异无统计学意义(P均>0.05)，术后7 d较术前1 d、术后1 d血清TGF-β、EGF均上升(P均<0.05)。两组组间血清TGF-β、EGF术前1 d及术后1 d比较差异无统计学意义(P均>0.05)，观察组术后7 d血清TGF-β、EGF均高于对照组(P均<0.05)。见表1。

表1 两组血清TGF-β、EGF水平比较

注：与对照组术后7 d比较，aP<0.05；与本组术后1 d比较，bP<0.05；与本组术前1 d比较，cP<0.05。

3 讨论

高位肛周脓肿因为创面大而开放，间歇排便持续污染导致创面愈合缓慢，过程痛苦一直是医学界最棘手的问题之一。目前所知，内源性生长因子、巨噬细胞和组织修复细胞释放和增殖受阻是延缓创面愈合的关键因素，组织修复细胞启动或激活增殖活动，调控创面愈合方向由被动转化为主动，是研究创伤修复的重点[7]。在创伤修复过程中，参与调控的细胞因子众多，其中TGF-β和EGF对创伤修复有重要促进作用[1,2]。

TGF-β在人类细胞中存在3种同分异构体，即β1、β2、β3。研究提示，3种异构体结构和功能相似，均为胞外信号分子诱导细胞膜上的两种受体(Ⅰ和Ⅱ)，并使具有相互作用的受体形成异聚体，磷酸化Smads蛋白，转导活化一系列信号蛋白，刺激核内表达特异基因和合成蛋白[8]。其中TGF-β1与伤口修复关系密切，在创伤初期，创面组织边缘中TGF-β1的表达增加较为明显[9]。TGF-β1主要从4个途径发挥其在创面修复中的作用：①早期的炎症反应阶段，TGF-β1能够趋化炎症细胞、聚集成纤维细胞，启动创伤修复；②TGF-β1促进成纤维细胞增殖，使其在创伤修复中发挥重要作用，加速伤口愈合；③抑制TGF-β/Smads信号通路的传导，减少创面瘢痕增生；④刺激活化细胞外基质成分，促进基质沉积交织，使创面修复[10]。研究表明，与对照组相比，Smads基因敲除小鼠的伤口皮肤愈合明显加快，可能与TGF-β/Smads信号通路被抑制，细胞增殖加速，促进组织重建有关[11]。

EGF是一种分子量为6 045 Da的小分子多肽，通过与靶细胞膜上的EGF受体结合发挥生物学效应。其主要作用包括：促进胞外主动向细胞内转运低分子量化合物；活化糖酵解促进呼吸代谢，刺激细胞外合成大分子糖蛋白；活化RNA，合成蛋白质、DNA，促进细胞增殖和果酸、列腺素等合成。研究显示，EGF对角朊细胞增殖和分化成熟起强力促进作用，对伤口再上皮化有推进功能，在表皮细胞的生长和增殖过程中作用重大[12]。EGF亦作用于多种间质细胞，如血管内皮细胞、血管平滑肌细胞、成纤维细胞及软骨细胞等，合成肉芽组织中细胞外大分子如DNA、RNA、蛋白质及胶原等，增加创面的基质，促进肉芽增生，加速创面愈合[13]。已有研究表明，EGF不仅能促进表皮细胞和全层皮肤组织细胞增殖，还对创伤愈合有重要作用，如促进上皮细胞、内皮细胞及成纤维细胞迁移，亦能增加内源性生长因子如TGF-β、血小板衍生生长因子的合成，发挥创面修复作用[14]。

VSD作用机制是通过负压对创面的持续性吸引，对创面的血液循环起到促进作用，利于创面坏死组织的清除，减少细菌污染，起减轻创面组织水肿、改善创面环境，最终达到加快肉芽组织生长愈合的目的。研究表明，VSD在各式软组织损伤和感染性创面的应用，取得了很好的临床效果[15]。VSD应用于肛周脓肿术后患者，能够明显促进患者的临床症状改善和机体功能恢复[4,16]，其作用的关键在于调控各种炎症介质及细胞因子(TGF-β、EGF等)，使免疫反应恢复并保持动态平衡，既不使之过度表达引起全身的炎症反应和多器官功能障碍综合征发生，又能明显促进创面的愈合[3]。VSD的作用机制是通过机械性牵张力对创面的持续施加，增加创面局部血流量，从而改善慢性创面的缺血、缺氧状态，减轻创面组织老化，改善机能，促进各类生长因子表达，增强各种细胞活性，抑制其凋亡活动[17]。本研究发现，两组组内血清TGF-β、EGF术后1 d与术前1 d比较差异无统计学意义，术后7 d较术前1 d、术后1 d血清TGF-β、EGF均上升；两组组间血清TGF-β、EGF术前1 d及术后1 d比较差异无统计学意义，观察组术后7 d血清TGF-β、EGF均高于对照组。因此，我们认为高位肛周脓肿患者经VSD治疗后，血清TGF-β、EGF水平明显升高，创面肉芽组织成纤维细胞的活性增强，微血管密度增加，修复细胞增殖活动增强，有助于创面修复。