慢性阻塞性肺疾病的早期诊断生物标志物初筛

，，， ， ，，，，

(1.广州市第十二人民医院呼吸内科，广东 广州 510620；2.环境保护部华南环境科学研究所 国家环境保护环境污染健康风险评价重点实验室 广东省水与大气污染防治重点实验室； 3.中国科学院广州地球化学研究所 有机地球化学国家重点实验室 广东省环境资源 利用与保护重点实验室；4.中国科学院大学；5.中国科学院城市环境研究所 中国科学院区域大气环境研究卓越创新中心)

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease, COPD)是全世界的常见多发的呼吸系统疾病，每年导致全球超过三百万人死亡，其中我国占一百多万，已成为全球(特别是我国)的重要公共健康问题[1-7]。COPD的早期诊断和治疗能显著改善患者的生命质量、降低死亡率，并减少其医疗费用。然而，当前COPD的诊断方法仍是传统的肺功能检查，但该方法存在不适用于所有年龄段的患者和无法进行早期诊断等诸多的局限性[8-10]。因此，突破传统诊断方法的局限性，发展新的COPD早期诊断方法则显得十分重要。

人体呼出气体中的挥发性有机物(volatile organic compounds, VOCs)携带大量的生理和病理信息，因此，基于呼出气VOCs分析将可为COPD的诊断提供有效的生物标志物，从而为快速评估疾病状态提供新的方法学支持[11]。但目前有关于COPD呼吸气诊断方面的研究相对较少，且存在：(1)主要采用离线采样和离线分析，无法满足快速诊断的要求；(2)前期研究结果千差万别，至今没有获得普适性的生物标志物等局限性[9, 12-18]。因此，本研究利用在线分析仪器质子转移反应-飞行时间质谱仪(proton transfer reaction-time of flight-mass spectrometer, PTR-TOF-MS)对比检测与分析15例COPD患者和50位与之匹配的健康者的吸入气和呼出气中VOCs的组分及浓度，期望获得更多的COPD的生物标记物，丰富生物标记物库，为建立COPD呼吸气早期诊断的方法提供基础科学数据。

1 资料与方法

1.1一般资料本研究招募了65名志愿者：15例COPD患者和50位与之匹配的对照健康者。15例患者为广州市第十二人民医院呼吸内科收治的COPD患者。所有受试患者均经临床诊断确认患有COPD，符合慢性阻塞性肺疾病全球倡议(global initiative for chronic obstructive lung disease, GOLD)标准[19]。根据GOLD指导方针，受试患者中5例被诊断为轻度或中度COPD(GOLD阶段I/II)，10例被诊断为重度或极重度COPD(GOLD阶段III/IV)。在呼吸气样品采集前，所有受试者依据国际GOLD指南推荐的呼吸量测定法，进行肺功能检查来确定患者的COPD发展阶段，主要的分析参数包括一秒用力呼气量(forced expiratory volume in 1 second, FEV1)、FEV1%预测值、用力肺活量(forced vital capacity，FVC)和FEV1/FVC。本研究获得广州市第十二人民医院伦理委员会批准。所有受试者均自愿签署知情同意书和填写个人信息表，具体包括性别、年龄、身高、体重、身体质量指数(body mass index, BMI)、吸烟喝酒状况和个人及家族的过去病史。COPD患者和健康对照组的基础数据见表1。

表1 COPD患者和健康对照组的基础数据

1.2主要仪器与装置肺功能测定仪(型号： MICRO QUARK；厂家：COSMED the Metabolic Company，罗马，意大利)；2L泰德龙采气袋(厂家：大连德霖气体包装有限公司，大连，中国)；质子转移反应-飞行时间质谱仪(型号：PTR-TOF 2000；厂家：Ionicon Analytik GmbH，因斯布鲁克，奥地利)。

1.3呼吸气采集和分析在采集呼吸气样品之前，所有受试者被要求在采样前至少一个小时内不能吸烟、吃食物、喝饮料(除水以外)和刷牙，并用纯净水漱口。其中，受试患者还须在采样前24小时停止使用长效支气管扩张剂或12小时停止吸入短效支气管扩张剂和糖皮质激素。

使用2L泰德龙采气袋采集每位受试者的一个吸入气(即周围环境空气)样品和两个呼出气样品。吸入气采集是使用玻璃注射器将受试者周围环境空气注入气袋中；而呼出气采集则是通过一段特氟龙管由受试者将肺部气体经口腔多次吹入采气袋，且选择采集呼出潮气末期的气体样品。所有样品均在室温下保存，样品采集后2 h内完成分析。

1.4质量保证和质量控制本研究应用PTR-TOF Data Analyzer(version 4.49)软件处理实验数据[20]，选用水合氢离子同位素(H318O+,m/z21.022)、水团簇离子同位素(H518O16O+;m/z39.033)、质子化的丙酮((C3H6O)H+;m/z59.049)和质子化的1,2,4-三氯苯((C6H3Cl3)H+,m/z180.937)进行质量校准。标准曲线的线性相关系数R2均大于0.997。各化合物的灵敏度，即标准化的信号响应(normalized counts per second, ncps)与其对应浓度水平(part per billion by volume, ppbv)，在10.51～40.08 ncps/ppbv之间。本研究中标准曲线的斜率即为灵敏度，也是校正因子[21]。方法检测限在0.039～0.086 ppbv之间，分析仪器的精密度(相对标准偏差)小于7%，准确度在±13%之间。

考虑吸入气和呼出气中湿度的巨大差异对目标化合物信号响应的影响，本研究应用de Gouw等[22]建议的方法计算生成物离子信号标准化响应。根据Stockwell等[21]和Sarkar等[23]提议的质量相关的灵敏度计算法，对本研究报道的但标气不含有的化合物进行定量计算。

1.5统计学分析实验数据应用SPSS 19.0软件进行统计分析。计量资料以均数±标准差表示。当数据通过正态性检验(P>0.05)时，t检验被用于检验两类独立样本的统计性差异。而当正态分布、方差齐性不能达到t检验的要求时，则使用非参数检验方法：曼-惠特尼U检验。双尾显著性检验被用于检验研究结果，P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 COPD患者与健康对照组呼出气对比本研究从质谱图中共提取出285个质量峰。首先，筛选出内源VOCs，当某化合物在呼出气中浓度高于吸入气中浓度，则该化合物可能是内源化合物，会被选为候选生物标记物。然后，为了消除环境因素影响，候选标志物显示的浓度均是呼出气浓度减去吸入气浓度的结果。最后，通过统计分析COPD患者与健康对照组呼出气VOCs浓度，发现18种VOCs在这两类人群中差异具有显著性(P<0.05，表2)。因此，这18种VOCs被确定为COPD呼出气的生物标志物，它们分别是丙炔、丙烯、乙醛、乙醇、乙酸、甲基乙烯基酮(methyl vinyl ketone, MVK)/甲基丙烯醛(methylacrolein, MACR)/丁烯醛、丁酮/正丁醛、丁胺、丙酸、环己二烯、戊烯醛、2-甲基丁醛、乙酸乙酯、丁酸、苯酚、二甲基苯甲醛、3,7-二甲基-1,3,6-辛三烯(罗勒烯)和松油醇。

表2 COPD患者与健康对照组呼出气VOCs标志物 的浓度及P值统计

此外，丙炔、乙醛、丁酮/丁醛、丁胺、2-甲基丁醛、乙酸乙酯和丁酸在COPD患者和健康志愿者之间具有更高水平的显著性差异(P<0.001)，它们的浓度在COPD患者和健康对照组之间没有重叠交集。因此，上述7种VOCs被认为是显著的COPD生物标志物。

2.2 COPD早期与晚期患者呼出气对比统计分析显示COPD早期(包括轻度和中度)与晚期(包括重度和极重度)患者的呼出气标志物浓度差异无显著性(P>0.05，表3)。

3 讨论

COPD是全世界的常见多发的呼吸系统疾病，每年导致全球超过三百万人死亡[24]。尤其是在我国，COPD更为盛行，从1990年～2013年它一直高居全国第三大致死病因，每年大约一百万人死于该病，约占全球COPD死亡人数的三分之一[3-4]。早期诊断和治疗是改善COPD患者的生命质量、延长寿命、降低死亡和降低医疗费用的关键。然而早期COPD呼吸症状在临床表现不明显，现行的肺功能检查不能对该阶段疾病做出全面准确的诊断[9]。因此，发展一种非侵入性且快捷的COPD早期诊断方法，则具有十分重要的实际应用意义。基于呼出气VOCs生物标志物分析的COPD诊断方法具备上述的优点，将是一种全新的评估COPD手段，从而为COPD的早期诊断提供新的思路。

表3 COPD早期与晚期患者呼出气VOCs标志物 的浓度及P值统计

本研究通过对比分析获得18种COPD的特征性呼气生物标志物，其中有5种化合物与前人的研究一致：罗勒烯和松油醇与Van Berkel等[12]研究发现一致；2-甲基丁醛则被Cristescu等[13]认为是肺气肿(COPD晚期症状)的生物标志物；乙酸和苯酚则分别为Phillips等[14]及Gaida等[15]提出为COPD呼出气生物标志物；Allers等[16]在两种检测仪器中均发现的生物标志物：2-戊酮与本研究现的生物标志物2-甲基丁醛是同分异构体，它们分子质量均为86 amu。上述5种化合物可确定为COPD患者呼出气的特征性生物标志物，应用于COPD的诊断。

本研究首次报道的13种COPD患者呼出气特征性化合物：丙炔、丙烯、乙醛、乙醇、甲基乙烯基酮(methyl vinyl ketone, MVK)/甲基丙烯醛(methylacrolein, MACR)/丁烯醛、丁酮/正丁醛、丁胺、丙酸、环己二烯、戊烯醛、乙酸乙酯、丁酸和二甲基苯甲醛，特别是其中的丙炔、乙醛、丁酮/丁醛、丁胺、2-甲基丁醛、乙酸乙酯和丁酸在COPD患者与健康者之间具有极显著性差异(P<0.001，表2)，具有作为COPD诊断生物标志物的潜在价值，但由于本研究招募到的COPD患者数不多，尚需进一步的深入研究。

此外，本研究获得的18种COPD生物标志物在COPD早期与晚期阶段浓度无显著性差异，表明这些标志物的浓度不会随着COPD的恶化程度而发生变化，但与健康者比较具有显著性的差异。因此，它们具有应用于COPD早期诊断的价值。

本研究的不足之处：实验中患病受试者数目相对较少，仅有15名受试者。后续我们将招募更多的COPD患者与健康对照者，从而提供更加可靠的统计分析结果。

综上所述，本研究初步筛选得到18种COPD患者的呼气特征性化合物，丰富了COPD呼出气的生物标志物库，其中5种与不同研究者基于不同国家或地区人群数据分析的结果一致，具有应用于COPD早期诊断的价值。13种新报道的化合物具有应用于COPD早期诊断的潜在价值，尚需后续进一步的研究证实。