三黄生肤油联合硫化氢对糖尿病足模型大鼠的治疗作用

孙晓顺 陈 露 敖先伟 张艳芳 朱贤静

末梢微循环障碍是糖尿病的严重并发症，糖尿病足(Diabetic Foot，DF)是因为高糖状态下末梢血供减少，再加上长期糖代谢紊乱使血液呈高凝状态，导致微血栓形成而堵塞血管，引起足溃疡。原发性病变使溃疡面往往难以愈合，增加了局部感染的机会，进一步破坏深部组织，严重者可导致患者截肢。DF属于糖尿病难治性并发症，一直是临床学者期望攻克的难点[1]。硫化氢可以抗炎、抗氧化、调控血管生成、促进组织损伤修复，已有学者将其用于DF模型鼠的治疗[2]。DF中医治疗以活血通络、益气化瘀、解毒生肌为主[3]。三黄生肤油具有益气活血、祛瘀生肌的功效，在DF的实验研究中已获得了较好的疗效[4]。本研究观察硫化氢联合三黄生肤油对DF模型鼠的治疗作用，为DF临床治疗方法的探索积累相关的实验数据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

60只6-8周健康雄性SD大鼠购自湖北省动物实验中心，动物许可号：SCXK(鄂)2016-0004， 体重210-230g，大鼠20-26℃条件下自由进食、饮水饲养，12h光照，12h黑暗，适应环境1 周后用于实验。

1.2 药剂和仪器

硫化氢、链脲佐菌素购自美国Sigma公司(生产批号：20160122、2016314)。三黄生肤油为我院中医室自制(由黄芪、黄连、黄芩、白芷、金银花、当归、川芎、紫草、地榆、红花、虫白蜡、血竭、赤芍、冰片、蝉蜕15 种中药浸润于麻油中熬制而成)。红外温度仪M312型购自上海御领科技有限公司，足底痛阈测试仪JS11P购自意大利Ugo Basile公司。

1.3 DF大鼠模型的构建

60只健康雄性SD大鼠高糖、高脂饲料(20%蔗糖、18% 猪油、3%蛋黄和59%基础饲料)喂养4周后，禁食12h， 65mg/kg链脲佐菌素腹腔注射(0.9%生理盐水溶解)，3天后测血糖，血糖大于16.7 mmol/L者选为糖尿病模型大鼠，其中48只造模成功。参照马帅等[3]的方法，使用切除皮肤法制造DF损伤：30mg/kg 戊巴比妥钠麻醉糖尿病模型大鼠，0.5%碘伏消毒左后足，作3mm×7mm 矩形全层皮肤切除，术后压迫止血，75%酒精消毒，制备DF溃疡大鼠模型。

1.4 动物分组及治疗方法

48只造模成功的DF大鼠使用数字表法分为基质对照组、硫化氢组、三黄生肤油组和三黄生肤油+硫化氢组，每组12只。基质对照组使用基质麻油涂抹创面后，无菌敷料覆盖患处并包扎，2次/天，连续3周；硫化氢组使用2%硫化氢0.1ml/cm2涂抹创面后无菌敷料覆盖患处并包扎，2次/天，连续3周；三黄生肤油组使用三黄生肤油0.15ml/cm2涂抹创面后无菌敷料覆盖患处并包扎，2次/天，连续3周；三黄生肤油+硫化氢组先使用2%硫化氢(0.1ml/cm2)涂抹创面后，再涂抹三黄生肤油0.15ml/cm2，随后无菌敷料覆盖患处并包扎，2次/天，连续3周。

1.5 观察指标

1.5.1 愈合率：于治疗后第1、2、3周时测定创面面积，用透明薄膜描记溃疡面积边缘后，扫描后输入电脑使用ImageJ软件计算创面面积，计算愈合率=(原有创面面积-治疗后测量创面面积)/原有创面面积×100%。

1.5.2 足底皮温：于治疗前、治疗后第1、2、3周时使用红外温度仪检测大鼠足底皮温。

1.5.3 足底痛阈：于冶疗前，治疗1、2、3周后在安静条件下使用足底痛阈测试仪，辐射热光照限值60s，记录模型鼠抬腿时间。

1.5.4 创面血管生成情况：第3周治疗结束后断颈处死模型鼠，取创面肉芽组织于10% 中性甲醛溶液固定后，送病理科制作组织切片，HE染色，显微镜下记录每个视野中血管的数目，选取5个视野计算平均值。

1.6 统计学处理

2 结果

2.1 各组大鼠创面愈合率比较

治疗1、2、3周后，四组大鼠创面愈合率差异均有统计学意义(P<0.05)。治疗1周后，与基质对照组比较，三黄生肤油+硫化氢组创面愈合率增加(t=2.916，P<0.05)，其余组间创面愈合率差异无统计学意义(t均<1.000，P>0.05)。治疗2、3周后，与基质对照组比较，其它组大鼠创面愈合率均增加(t均>2.873，P<0.05或P<0.01)，三黄生肤油+硫化氢组较硫化氢组和三黄生肤油组创面愈合率均增加(t均>2.053，P<0.05)，硫化氢组与三黄生肤油组创面愈合率差异无统计学意义(t均<1.000，P>0.05)。同组内创面愈合率治疗1、2、3周后差异均有统计学意义，且均呈治疗1周<治疗2周<治疗3周，差异均有统计学意义(t均>4.512，P<0.01)。见表1。

表1 四组大鼠创面愈合率比较均=12)

注：与基质对照组比较,1)P<0.05；2)P<0.01；与硫化氢组比较,3)P<0.05；与三黄生肤油组比较,4)P<0.05;与同组治疗1周比较，5)P<0.01;与同组治疗2周比较，6)P<0.01

2.2 各组大鼠足底皮温比较

治疗前以及治疗1周后四组大鼠足底皮温无显著性差异(P>0.05)。三黄生肤油+硫化氢组治疗2、3周足底皮温高于基质对照组(t=2.614、3.115，P<0.05)。治疗3周后硫化氢组和三黄生肤油组足底皮温高于基质对照组(t=2.603、2.618，P< 0.05)，硫化氢组与三黄生肤油组间无显著性差异(P>0.05)，三黄生肤油+硫化氢组足底皮温高于硫化氢组和三黄生肤油组(t=2.817、2.823，P< 0.05)。除基质对照组处，其余各组治疗3周后足底皮温较同组治疗前明显升高(P<0.05),差异均有统计学意义。见表2。

表2 四组大鼠足底皮温的比较(℃，均=12)

注：与基质对照组比较,1)P<0.05；与硫化氢组比较,2)P<0.05；与三黄生肤油组比较,3)P<0.05;与同组治疗前比较，4)P<0.05

2.3 各组大鼠足底痛阈比较

从表3可见，治疗前及治疗1周后，四组足底痛阈无显著性差异(P>0.05)。三黄生肤油+硫化氢组治疗2、3周足底痛阈低于基质对照组(t=2.864、3.122，P<0.05)。治疗3周后，硫化氢组和三黄生肤油组足底痛阈低于基质对照组(t=2.933、2.924，P<0.05)，硫化氢组与三黄生肤油组间无显著性差异(t=0.714，P>0.05)。三黄生肤油+硫化氢组足底痛阈低于硫化氢组和三黄生肤油组(t=2.712、2.728，P<0.05)。除基质对照组外，其余各组治疗3周后足底闻阈较同组治疗前降低，差异均有统计学意义(t均>2.735，P<0.05)。

表3 四组大鼠足底痛阈的比较均=12)

注：与基质对照组比较，1)P<0.05；与硫化氢组比较，2)P<0.05；与三黄生肤油组比较，3)P<0.05；与同组治疗前比较，4)P<0.05

2.4 各组大鼠创面血管生成比较

治疗3周后，显微镜高倍视野下计数得到基质对照组、硫化氢组、三黄生肤油组和三黄生肤油+硫化氢组模型鼠创面肉芽组织中新生血管数分别为12.64±1.43个、13.78±1.62个、13.86±1.67个和16.62±2.41个，组间有显著性差异有统计学意义(F=2.842，P<0.05)，见图1。硫化氢组、三黄生肤油组和三黄生肤油+硫化氢组均较基质对照组比较均增加(t=2.742、2.756、3.426，P<0.05)，硫化氢组和三黄生肤油组新生血管数差异无统计学意义(t=0.217，P>0.05)，三黄生肤油+硫化氢组新生血管数均高于硫化氢组和三黄生肤油组(t=3.215、3.204，P<0.05)。

图1 四组创面肉芽组织病理图片(HE,×200 )

3 讨论

实验性DF大鼠模型制作有很多方法，例如单纯高脂饮食诱导法、链脲佐菌素诱导法、高脂灌胃与四氧嘧啶诱导结合法，再结合切除皮肤法、温控损伤法、局部皮肤压迫法、局部感染法、结扎血管法、结扎神经法等[5]。本研究选用了链脲佐菌素诱导+切除皮肤法，药物破坏胰岛 B 细胞，造成胰岛素缺乏，符合糖尿病胰岛细胞损伤的特点，剪去造模区皮肤操作简单，重复性好，溃疡面积形态可控，便于相互之间的比较，基本满足DF的实验研究[6]。足溃疡在糖尿病患者中的发生率为 15%-25%，末梢血管及神经病变是其主要成因，改善末梢血管的局部微循环，增加创面血管生成，有利于溃疡面的愈合[7]。

三黄生肤油中黄芪、黄连、黄芩可以清热解毒，化腐生肌，当归、川芎活血通络、温阳养血，蝉蜕、地榆、红花、虫白蜡、血竭活血通脉、养阴益气，白芷、金银花、紫草、赤芍、冰片解毒消肿、生肌止痛，合用后促进新生血管、肉芽组织和上皮细胞形成，改善微循环，促进创面愈合[2]。而硫化氢具有抗炎作用，有研究显示硫化氢可减少烧伤大鼠创面白细胞介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子-ɑ(TNF-ɑ)等炎性介质水平[8]，同时还可减少新生肉芽组织中性粒细胞及单核巨噬细胞浸润程度，对创面愈合具有调控作用[9]。

本文结果显示，硫化氢组和三黄生肤油组治疗2、3周创面愈合率高于基质对照组，但两组间创面愈合率无显著性差异，表明硫化氢和三黄生肤油都有利于足底皮损的修复，且二者的促增长作用无差异。三黄生肤油+硫化氢组治疗1、2、3周创面愈合率均高于基质对照组，治疗2、3周创面愈合率高于硫化氢组和三黄生肤油组，即联合治疗比三黄生肤油或硫化氢单药治疗更加有利于模型鼠足创面的愈合，这可能是两药促修复的机制不同，合用后增加各自的疗效[2，7]。

三黄生肤油组治疗3周后，模型鼠足底皮温和足底痛阈也得到了显著改善。三黄生肤油+硫化氢治疗2、3周后，模型鼠足底皮温高于和足底痛阈显著低于基质对照组，治疗3周后足底皮温高于和足底痛阈显著低于硫化氢组或三黄生肤油组，说明了联合治疗比三黄生肤油或硫化氢组单药治疗更加有利于模型鼠足底皮温和痛阈的改善，足底皮温和痛阈可以反应足底末梢循环障碍的情况[10,11]，可能是联合用药增加了模型鼠的末梢循环，产生了比单药使用更高的疗效。显微镜高倍视野下三黄生肤油组+硫化氢组创面肉芽组织中新生血管数显著高于其它三组，说明了联合用药后发生了促血管生成的增效作用，创面愈合率分析也显示了联合用药组显著高于其它3组，说明了联合用药有利于创面的愈合。

综上所述，本研究表明三黄生肤油联合硫化氢钠可改善DF模型鼠足部微循环，增加创面血管生成，有利于创面的愈合，为DF的临床治疗提供了一种可供探讨的新的治疗方法。