辽宁地区猪伪狂犬病毒病原学检测与遗传演化分析

杨洺扬，杨本勇，申贯男，关 淼，李井春，梁 乔，张 健，李 蓉，王宏燕，杨国丽

（辽宁省动物疫病预防控制中心，辽宁 沈阳 110164）

伪狂犬病（Pseudorabies，PR）是由伪狂犬病毒（Pseudorabies virus，PRV）（疱疹病毒1型，奥耶兹氏病病毒Aujeszky’disease virus）引起的多种家畜和野生动物共患传染病［1］。伪狂犬病毒可感染犬、猫、老鼠、山羊、绵羊、牛、猪和多种野生动物等，但猪是伪狂犬病毒唯一自然宿主［2-3］。猪只感染后主要表现为母猪繁殖障碍和仔猪神经症状并伴有较高的死亡率。目前该病在我国已广泛存在，给我国养猪业造成极大经济损失，我国农业部已将其列为二类动物疫病［4-7］。

伪狂犬病毒是属于水痘病毒属，疱疹病毒科，α疱疹病毒亚科的线型双股DNA病毒，目前仅有1个血清型。病毒基因组共包含143 461个脱氧核糖核苷酸以及不少于72个开放阅读框编码的约70个病毒蛋白。其中gD基因所编码蛋白是重要的中和抗原，与诱导产生免疫保护反应有关［8］。gE基因是主要的毒力基因之一，能够促进感染细胞与非感染细胞间的融合，介导病毒的细胞间扩散，是伪狂犬病毒入侵中枢神经的必需致病因子［9］。因此，gD、gE蛋白基因序列的比对分析对于伪狂犬病毒的遗传演化分析具有重要意义［10-11］。

本研究对辽宁地区采集的猪组织脏器样品进行猪伪狂犬病毒实时荧光PCR试验检测，将其中1株阳性毒株命名为LNP-1株并进行gD、gE基因测序和遗传进化分析，为深入研究辽宁省猪伪狂犬病流行规律提供科学的依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品来源2017年8月，辽宁省某无害化处理厂采集猪组织脏器30份。

1.1.2 主要试剂DNA提取试剂DNA/RNA磁珠法核酸提取试剂盒购自天隆科技公司，荧光PCR反应试剂猪伪狂犬病毒（gE基因）实时荧光PCR检测试剂盒购自世纪元亨公司，PCR反应试剂高GC含量模板PCR扩增试剂盒购自生工生物公司，凝胶回收试剂DNA片段纯化回收试剂盒购自Omega公司，其他化学试剂为分析纯。

1.1.3 引物参照GenBank已登录的Ea株、Fa株、JS-2012株、Battha株等参考毒株的基因组序列，应用Primer 5.0软件设计针对gD基因和gE基因的特异性扩增引物（gD1、gE1），2对引物均由生工生物技术有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 病毒提取和实时荧光PCR检测按照DNA/RNA提取试剂盒说明书和猪伪狂犬（gE基因）实时荧光PCR检测试剂盒说明书方法进行。

1.2.2 gD基因/gE基因PCR扩增利用引物gD1/gE1扩增伪狂犬病毒gD/gE基因序列，反应体系25 μL：DNA模 板 2.5 μL，2×High GC PCR Buffer（withMg2+）12.5 μL，上、下游引物各 1 μL，dNTP Mix 0.25 μL，Taq DNA Polymerase 0.25 μL，Sterilized ddH2O 7.5 μL补足。反应程序gD：95℃5 min，94℃50 s，55℃45 s，72℃75 s,72℃10 min。gE：95℃5 min，94℃50 s，56.5℃45 s，72℃100 s，72℃10 min。PCR扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测。

表1 引物Table 1Primers

1.2.3 目的片段回收测序利用DNA片段纯化/回收试剂盒回收目的片段，送至生工生物技术有限公司进行基因测序。

1.2.4 gD基因/gE基因序列拼接分析比对利用DNA-STAR软件Editseq和Megalign程序进行gD基因/gE基因序列拼接，与GenBank中登录的PRV参考毒株进行同源性比较并构建基因系统进化树，分析毒株遗传演化规律。

2 结果与分析

2.1 实时荧光 P C R检测结果对采集自无害化处理厂30份猪组织脏器样品进行DNA核酸提取实时荧光PCR检测。结果表明，4份样品为伪狂犬gE基因核酸阳性，将其中一株命名为LNP-1株CT值16.2（如图1）。

2.2 g D/ g E基因 P C R扩增结果将LNP-1株利用gD/gE基因引物特异性扩增，经琼脂糖凝胶电泳检测显示符合扩增目的片段大小（如图2），经纯化回收后送生物公司测序。

2.3 g D/ g E基因序列分析比对结果

2.3.1 gD基因分析比对结果PRV LNP-1株gD基因全长1 203 bp，序列相对保守。gD基因的同源性分析结果（如图3）表明PRV LNP-1株的gD基因与其他分离株的核酸序列同源性均在98%以上。其与TJ株，HeN1株的gD基因序列同源性最高，达到99.9%。以GenBank中提取的部分代表毒株gD基因序列作为参考序列构建系统进化树（如图4）。结果表明LNP-1株gD基因与TJ、HeN1、ZJ01等近年来我国分离毒株遗传关系接近，有相同进化源。与另一分支的Bartha、Kaplan、Kolchis等早期国外经典毒株遗传关系较远。将基因序列进行比对发现，gD基因与经典疫苗毒株Bartha株gD基因相比在831～836位之间插入了连续的6个碱基，存在多个A-G替换（如图5）。

图1 实时荧光PCR检测结果Fig.1 Detection result by real-time fluorescent quantitative PCR

图2 LNP-1株基因扩增结果Fig.2 RT-PCR amplication of LNP-1

图3 PRV LNP-1株和参考毒株间的gD基因的同源性比较Fig.3 Sequence similarility of gD gene of LNP-1 and other reference strains

图4 PRV LNP-1株gD基因进化树分析Fig.4 Phylogenetic analysis of PRV LNP-1 gD gene

图5 PRV LNP-1株和参考毒株间的gD基因的序列分析Fig.5 Sequence analysis of gD gene of LNP-1 and other reference strains

图6 PRV LNP-1株和参考毒株间的gE基因的同源性比较Fig.6 Sequence similarility of gE gene of LNP-1 and other reference strains

2.3.2 gE基因分析比对结果 PRV LNP-1株gE基因全长1 740 bp。gE基因的同源性分析结果（如图6）表明，PRV LNP-1株的gE基因与其他分离株的核酸序列同源性在96.9～99.8%之间。LNP-1株的gE基因与近年来国内分离株（JS-2012株、HLJ8株、HB-BD株）的基因序列同源性最高，达到99.8%。而与其他不同年份分离的毒株同源性相对较低。以GenBank中登录的部分gE基因全序列作为参考序列，构建系统进化树（如图7）。表明LNP-1株gE基因与HB-BD株、HLJ8株、ZJ01株、JS2012株、HeN1株等近年来我国分离毒株遗传关系接近，有相同进化源。与另一分支的NIA3、Becker、Kaplan、Kolchis等早期国外经典毒株遗传关系较远。将LNP-1 gE基因与其他参考毒株两两比对分析表明其与不同毒株间存在部分碱基替换，其中以A-G替换为主。另外，与其他参考毒株进行多序列比对，发现LNP-1 gE基因序列中最具特征性的变化就是在两个部位分别存在3个连续碱基的插入，分别是第142～144位GAC插入以及1 488～1 490位CGA的插入（如图8）。

图7 PRV LNP-1株gE基因进化树分析Fig.7 Phylogenetic analysis of PRV LNP-1 gE gene

图8 PRV LNP-1株和参考毒株间的gE基因的序列分析Fig.8 Sequence analysis of gE gene of LNP-1 and other reference strains

3 讨论

本研究结果分析表明PRV LNP-1毒株基因与HeN1株、TJ株、ZJ01株、JS-2012株等近年来我国分离毒株遗传关系接近，有相同进化源。与另一分支的Bartha、Kaplan、Kolchis等早期国外经典毒株遗传关系较远。基因序列比对发现，gD基因与经典疫苗毒株Bartha株gD基因相比在831～836位之间插入了连续的6个碱基即增加2个氨基酸，并有多个A-G替换，相关学者推断可能会导致抗原性及免疫原性发生变化［12-13］。gE基因与近年来国内分离变异毒株（JS-2012株、HLJ8株、HB-BD株）的基因序列同源性很高，并且基因序列中第142～144位和1 488～1 490位分别存在GAC和CGA碱基插入，从而增加了1个天冬氨酸，符合近年国内伪狂犬变异毒株gE基因突变特征，因此推断PRV LNP-1毒株可能为伪狂犬变异毒株，但该突变是否能够改变病毒毒力和抗原性，导致目前疫苗免疫失败仍需进一步研究［14-16］。