高效液相色谱法检测饲料添加剂样品中的辣椒素类似物

陈玉艳，于家丰

（辽宁省兽药饲料畜产品质量安全检测中心，辽宁 沈阳 110016）

辣椒是生活中常见的食品、香辛料和调味品。辣椒素又称辣椒碱，是辣椒的活性成分，是辣椒的次级代谢产物，对哺乳动物包括人类都有刺激性并可在口腔中产生灼烧感，不仅可作为食品添加剂，在医药保健、海洋防污及电线电缆的防蚁防鼠等方面同样具有着广阔的应用。从辣椒中提取分离出的辣椒碱作为食品加工过程中的添加剂，有利于辣度的控制和辣椒碱的充分吸收利用。另外，现代研究表明，辣椒碱具有消炎、镇痛、麻醉和戒毒等方面的功效，还可抑制肿瘤的发生，对皮肤病和减肥拥有特殊功效[1-3]。辣椒素作为驱避剂，因其强烈辛辣味具有较强驱赶作用，并且不杀死海洋生物，具有明显的生态效益。二氢辣椒素具有杀菌消毒的作用，可作为食品防腐剂，还可促进胃肠蠕动及胃液分泌，帮助消化。

辣椒素类物质是一种混合物，目前己经确定有19种成分，其中辣椒素、二氢辣椒素等5种组分的含量最高，之和已占总量99%左右，5种化合物中又以辣椒素（占总量69%）、二氢辣椒素（占总量22%）含量高，二者之和占总量91%，降二氢辣椒素占到7%[4]。

对辣椒素类似物检测方法有多种，包括化学分析方法和仪器分析方法，前者有凯氏定氮法[5]，后者有紫外可见光光度法[6]、三维荧光光谱法[7]、高效液相色谱法。高效液相色谱法适用于复杂成分混合物的分离、定性与定量，效果较好，根据辣椒素类物质的结构特点和光吸收特性，一般采用反相化学键合相，紫外检测器检测。该方法是目前国内外食品或蔬菜行业在辣椒素类物质测定研究中使用较多的方法。它具有快速、灵敏、准确度高、操作简单的优点，能同时分离、测定辣椒素类物质的主要辣味成分，但在饲料添加剂领域的相关检测方法研究未见报道。

食品中辣椒素的测定方法提取液选的是甲醇-四氢呋喃溶液[8]，流动相也是甲醇-水溶液[9-11]，甲醇、四氢呋喃试剂提取试剂较贵，甲醇对检测人员存在危害。本研究发现乙醇提取、乙腈-水流动相分离效果良好，适用于基质复杂的饲料添加剂中辣椒素类似物的检测，实际应用中更为适合。

1 材料与方法

1.1 试剂和溶液乙醇：色谱纯。国药集团化学试剂有限公司；乙腈：色谱纯。Fisher公司；试验用水；辣椒素标准品：含量99%；二氢辣椒素标准品：含量99%；降二氢辣椒素标准品：含量99%。

1.2 仪器设备Waters高效液相色谱仪2695：配双通道2998紫外检测器，美国Waters公司；Waters C8色谱柱：粒度5 μm，长度150㎜，内径3.9㎜，美国Waters公司；AT200分析天平；回流冷凝器；微孔滤膜：0.45 μm。

1.3 试验方法

1.3.1 色谱条件 色谱柱：C8柱（5 μm，150 mm×3.9 mm）；流动相：乙腈-水（40:60）；流速：1.00 mL/min；检测波长：280 nm，色谱扫描范围210～400 nm。

1.3.2 标准品的制备标准溶液浓度0.15 mg/mL。准确称量75 mg辣椒素、二氢辣椒素、降二氢辣椒素标准品分别至500 mL容量瓶中，用乙醇定容至刻度并混匀。用一次性注射器吸取适量过0.45 μm滤膜于棕色液相小瓶中，上机测定。图谱结果如图1～4。

图1 辣椒素标准品色谱图Fig.1Chromatogram of capsaicin

图2 二氢辣椒素标准品色谱图Fig.2 Chromatogram of dihydrocapsaicin

图3 降二氢辣椒素标准品色谱图Fig.3 Chromatogram of noradihydrocapsaicin

图4 对照品色谱图（色谱峰依次是降二氢辣椒素、辣椒素和二氢辣椒素）Fig.4 Chromatogram of noradihydrocapsaicin,capsaicin,dihydrocapsaicin

从图1～4可以看出，辣椒素的保留时间在10 min左右，降二氢辣椒素的保留时间在9 min左右，二氢辣椒素的保留时间在14 min左右。由此可判断STD标准对照品图谱3个色谱峰依次是降二氢辣椒素、辣椒素和二氢辣椒素。

1.3.3 样品提取 本方法研究的饲料添加剂基质有辣椒酊、辣椒粉、氢化棕榈油、葡萄糖等。准确称量25 g饲料添加剂样品样品加入到500 mL蒸馏烧瓶中，向其中添加200 mL乙醇和少许沸石，按照从上到下、从左到右安装装置，烧瓶连接回流冷凝器，60℃下缓慢回流4 h，冷却。提取液用0.45 μm微孔滤膜过滤至液相小瓶，上机测定。三批次样品，每批次双平行处理，结果见表1。

2 结果与分析

表1 不同样品中辣椒素类似物的色谱峰面积Table 1 Chromatographic peak area of capsaicin analogues in different samples

2.1 加标回收试验按照上述样品提取、色谱分析条件进行分析，分别取同一饲料添加剂样品，添加0.94、1.88、3.76 mg/g 3个质量浓度的辣椒素标准溶液，进行加标回收试验，试验结果见表2。

表2 饲料添加剂样品中的降二氢辣椒素、辣椒素、二氢辣椒素回收率测定结果Table 2Determination results of recovery rates of no radihydroca psaicin、capsaicin、dihydroca psaicin

由表2可知，降二氢辣椒素、辣椒素、二氢辣椒素的加标回收率分别为91.39%～102.78%、85.91%～101.96%、89.16%～96.86%，说明本方法准确度高，方法有效可行。

2.2 精密度试验取含量为0.15 mg/mL的3种辣椒素类似物的STD标准对照品溶液进行检测，进样10 μL，重复测试6次，通过对色谱峰面积的比较来反映仪器精密度。测定降二氢辣椒素、辣椒素和二氢辣椒素的RSD分别为0.75%、0.92%和0.38%。表明测试仪器在该色谱条件下有良好的精密度。

2.3 重复性试验取同一批次饲料添加剂样品，按上述方法提取6个平行样品进行测定。降二氢辣椒素RSD=1.93%，辣椒素RSD=1.18%，二氢辣椒素RSD=1.61%，表明本方法重复性良好。

3 讨论和结论

本研究建立了饲料添加剂中辣椒素、二氢辣椒素、降二氢辣椒素的提取技术和高效液相色谱检测方法。在此检测条件下，最后出峰的二氢辣椒素保留时间大概在14.6 min，与辣椒及辣椒制品中辣椒素物质测定的相关方法比较[11-12]，保留时间大概缩短6～11 min，在大批量的样品分析中能节省大量的试剂成本和时间成本，且可以规避甲醇-水流动相黏度大、伤柱子、峰性差等缺点，具有实际应用价值。

降二氢辣椒素、辣椒素、二氢辣椒素的加标回收率分别平均为97.52%、93.72%、93.99%，能满足分析要求，精密度RSD＜1%，显示仪器精密度良好，测定结果满意，重复性试验RSD＜2%，再现性结果满意。

试验结果显示，样品中含量最多的是辣椒素，二氢辣椒素次之，降二氢辣椒素最少，与已知理论相符。所建立的分析方法样品前处理提取试剂及流动相对试验人员人身健康有帮助，方法简便快捷，易于操作，高效准确，能够很好地检测出复杂基质饲料添加剂样品中3种辣椒素物质的含量，适合批量检测，值得推广。在本检测方法的基础上，可以进一步研究色谱分离方法，可以考虑梯度洗脱，以便更高通量地检测更多种辣椒碱类活性物质。