黄党银淫甘组方对鸡免疫器官指数和淋巴细胞增殖的影响

李美莹，宋 依，王艳萍，闫伊狄，杜 航，臧静楠，李敬双，于 洋

（锦州医科大学，辽宁 锦州 121001）

畜禽疾病特别是病毒性疾病仍然是阻碍养殖业健康发展的瓶颈，在现代规模化养鸡中，新城疫（Newcastal disease，ND）对养禽业危害尤为突出，是我国重点预防的重大传染病之一，该病传染性强，对养禽业造成很大的经济损失，目前疫苗是防治该疾病最有效的方法。国内外学者在进行疫苗免疫的同时，常将疫苗与免疫增强剂同时使用，以此达到加强免疫效果、延长免疫时间等作用[1]。然而目前兽医临床上所常用的化学免疫增强剂药物残留量大，易引发公共卫生问题。因此，寻找残留量小、安全性高、作用确切的药物，已成为目前免疫增强剂开发研究的新方向。中药免疫增强剂对机体的细胞免疫和体液免疫功能具有增强或调节作用，可提高机体的抗病力和抵抗力，显示了较强的增强机体免疫功能的作用，且中药种类丰富，价格低廉，可克服抗生素和化学药物的长期大量使用导致的公共卫生问题[2]。因此，在传统中医理论与现代科学技术基础上，研究新型中药免疫增强剂，提高疫苗的预防效果，对保障养禽业健康发展具有非常重要的意义。

黄芪、党参、银杏外种皮、淫羊藿和甘草都是我国传统的中药，广泛应用于临床。黄芪是传统中医中常用的中药之一，李时珍在《本草纲目》将其称为“补药之长”，黄芪主要成分是多糖、黄酮、三萜等，具有增强免疫、抗肿瘤、抗病毒、延缓衰老等功效[3]。党参为中国常用的传统补益药，党参主要成分是多糖、苷类、生物碱、三萜等，具有增强免疫、调节血糖、延缓衰老、降血压、抗缺氧、缓解疲劳等功效[4]。淫羊藿是一种传统的补益中药，淫羊藿主要成分是淫羊藿总黄酮、淫羊藿多糖、萜类化合物、淫羊藿苷、生物碱等，具有调节心血管系统、免疫系统、血脂、血糖等功效[5]。银杏外种皮的主要成分是银杏多糖、黄酮类、内酯类、银杏酚酸等，具有增强免疫功能、杀菌、抑菌、抗肿瘤、清除自由基等功效[6]。甘草中含有多糖类、黄酮类、三萜类等物质，具有增强免疫、抗肿瘤、抗炎、抗病毒等功效[7]。

本研究采用黄芪、党参、银杏外种皮、淫羊藿和甘草（简称黄党银淫甘）组方，从细胞和整体水平初步探讨黄党银淫甘的免疫增强效果，为中药免疫增强剂的开发和利用提供试验依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料 1日龄海兰褐公鸡雏（锦州医科大学实习农场）；雏鸡配合饲料（北京农大利生物技术有限公司）；黄芪、党参、银杏种皮、淫羊藿和甘草（锦州市东北大药房，黄芪产地是甘肃陇西县，党参产地是山西潞州，银杏种皮产地是江苏省邳州市，淫羊藿产地是甘肃陕西，甘草产地是宁夏盐池县）；左旋咪唑（广东华南药业集团有限公司）；磷酸盐缓冲溶液（PBS）（厦门海标科技有限公司）；RPMI-1640培养液（上海北诺生物科技有限公司）；新生胎牛血清（FBS）和四甲基偶氮唑盐（MTT）标准品（郑州九龙生物制品有限公司）；氯化铵（NH4Cl）（上海北诺生物科技有限公司）；三羟甲基氨基甲烷（tris）、台盼蓝和二甲基亚砜（DMSO）（北京索莱宝科技有限公司）。

1.2 主要仪器超净工作台（苏州净化设备有限公司）；低速离心机（湖南赫西仪器装备有限公司）；96孔和24孔板台式离心机（上海安亭科学仪器厂）；倒置显微镜（瑞士TeCan公司）。

1.3 试剂的制备四甲基偶氮唑盐（MTT）溶液配制：称取MTT标准品100 mg，加入新生牛血清20 mL，配制成MTT溶液，避光保存。Tris-NH4Cl配制：称取tris 1.3 g，NH4Cl 3.735 g，加入三蒸水溶解至500 mL，0.22 μm滤膜过滤除菌。

1.4 黄党银淫甘的制备黄党银淫甘按质量分数计算。即40%黄芪、20%党参、20%银杏外种皮、10%淫羊藿和10%甘草，用材料总质量10倍的三蒸水浸泡24 h，用武火使药液迅速沸腾，然后改用文火使药液保持沸腾煎煮2 h后过滤，收集滤液，滤渣加5倍量的三蒸水用武火使药液迅速沸腾，然后改用文火使药液保持沸腾煎煮2 h后过滤，收集滤液，两次滤液放入一起浓缩至含中药材1 g/mL。

1.5 试验分组与饲养方法 1日龄健康海兰褐公鸡雏150只，设空白对照组、阳性对照组、25、50和100 g/L黄党银淫甘组，每组30只。自由采食、饮水，按常规免疫程序进行免疫。1日龄在阳性对照组饮水中按50 mg/L加入左旋咪唑，25、50和100 g/L黄党银淫甘组饮水中分别按25、50和100 g/L加入黄党淫银甘。

1.6 黄党银淫甘对免疫器官指数的影响参考郝璐等[8]试验操作方法，28日龄时采用称重法检测免疫器官指数，每组随机抽取20只雏鸡，空腹称量活重，然后颈部放血致死，取出胸腺、法氏囊和脾，称其重量。胸腺、法氏囊和脾指数分别等于胸腺、法氏囊和脾的重量（g）除以宰前空腹活重（kg）。

1.7 黄党银淫甘对脾淋巴细胞增殖的影响

1.7.1 脾淋巴细胞分离培养 参照李敬双等[9]试验操作方法，在28日龄每组随机抽取5只鸡，颈部放血致死，用75%酒精浸泡5 min，无菌操作取出脾，放于培养皿中，用PBS冲洗2次，置于盛有RPMI-1640培养液的培养皿中，用注射器拉杆柄将其磨碎，200目滤网过滤。收集细胞悬液，1 000 r/min离心5 min，弃上清，沉淀加3 mL Tris-NH4Cl轻轻吹匀，放置5 min去除红细胞，1 000 r/min离心5 min，弃上清，直至红细胞完全裂解。用完全RPMI-1640培养液将细胞沉淀悬起，用台盼蓝染色计数，细胞活力达到95%以上，将细胞密度调整为5×106个/mL，制成淋巴细胞悬液，备用。

1.7.2 MTT法检测黄党银淫甘对脾淋巴细胞增殖的影响 参考Yu等[10]试验操作方法，设空白对照组、阳性对照组、20、40和80 g/L黄党银淫甘组。用96孔细胞培养板，每组均设7个复孔，每孔加入100 μL淋巴细胞悬液，再分别加入100 μL的RPMI-1640完全培养液，置于37℃，5%CO2培养箱中培养44 h，每孔分别加入20 μL MTT溶液，继续培养4 h，1 800 r/min离心10 min，弃上清，再每孔分别加入150 μL DMSO溶液，酶标仪在570 nm处检测OD值。用刺激指数表示淋巴细胞的增殖，刺激指数等于用药组OD值除以空白对照组OD值。

1.8 统计学处理 数据以平均数±标准差表示，组间差异性用SPSS 17.0统计软件进行一维方差分析，P＜0.05表示差异显著，P＜0.01表示差异极显著。

2 结果与分析

2.1 黄党银淫甘对免疫器官指数的影响

2.1.1 黄党银淫甘对胸腺指数的影响 黄党银淫甘对胸腺指数的影响见表1。

黄党银淫甘组各浓度组胸腺指数均极显著（P＜0.01）高于空白对照组，表明黄党银淫甘能够促进胸腺的发育。且呈剂量依赖关系，胸腺指数随药物剂量的升高而提高，当药物达到一定量时随药物剂量的升高而降低；黄党银淫甘组各浓度组胸腺指数均极显著（P＜0.01）高于阳性对照组，进一步说明黄党银淫甘能够促进胸腺的发育；50 g/L黄党银淫甘组胸腺指数均极显著（P＜0.01）高于25 g/L和100 g/L黄党银淫甘组，表明50 g/L黄党银淫甘组对促进胸腺发育的效果优于25 g/L和100 g/L黄党银淫甘组。

表1 黄党银淫甘对胸腺指数的影响（n=20）Table 1 Effect of HDYYG on Thymus Index

2.1.2 黄党淫银甘对法氏囊指数的影响 黄党银淫甘对法氏囊指数的影响见表2。

表2 黄党银淫甘对法氏囊指数的影响（n=20）Table 1 Effect of HDYYG on Bursa Index

黄党银淫甘各浓度组法氏囊指数均极显著（P＜0.01）高于空白对照组，表明黄党银淫甘能够促进法氏囊的发育。且呈剂量依赖关系，法氏囊指数随药物剂量的升高而提高，当药物达到一定量时随药物剂量的升高而降低；50 g/L和100 g/L黄党银淫甘组法氏囊指数均极显著（P＜0.01）高于阳性对照组，25 g/L黄党银淫甘组显著（P＜0.05）高于阳性对照组，进一步表明黄党银淫甘能够促进法氏囊的发育；50 g/L黄党银淫甘组法氏囊指数极显著（P＜0.01）高于25 g/L和100 g/L黄党银淫甘组，表明50 g/L黄党银淫甘组对促进法氏囊发育的效果优于25 g/L和100 g/L黄党银淫甘组。

2.1.3 黄党银淫甘对脾指数的影响黄党淫银甘对脾指数的影响见表3。

表3 黄党银淫甘对脾指数的影响（n=20）Table 3Effect of HDYYG on Spleen Index

黄党银淫甘各浓度组脾指数均极显著（P＜0.01）高于空白对照组，表明黄党银淫甘能够促进脾的发育。且呈剂量依赖关系，脾指数随药物剂量的升高而提高，当药物达到一定量时随药物剂量的升高而降低；黄党银淫甘各浓度组脾指数均极显著（P＜0.01）高于阳性对照组，进一步表明黄党银淫甘能够促进脾的发育；50 g/L黄党银淫甘组脾指数极显著（P＜0.01）高于25 g/L黄党银淫甘组，显著（P＜0.05）高于100 g/L黄党银淫甘组，表明50 g/L黄党淫银甘对促进脾发育的效果优于25 g/L和100 g/L黄党银淫甘组。

2.2 黄党银淫甘对脾淋巴细胞增殖的影响黄党银淫甘对淋巴细胞增殖的影响见表4。

表4 黄党银淫甘对淋巴细胞增殖的影响（n=7）Table 4 Effect of HDYYG on Lymphocyte Proliferation

黄党银淫甘各浓度组脾淋巴细胞刺激指数均极显著（P＜0.01）高于空白对照组，表明黄党银淫甘能够刺激脾淋巴细胞的增殖。且呈剂量依赖关系，脾淋巴细胞刺激指数随药物剂量的升高而提高，当药物达到一定量时随药物剂量的升高而降低；50 g/L和100 g/L黄党银淫甘组脾淋巴细胞刺激指数均极显著（P＜0.01）高于阳性对照组，25 g/L黄党银淫甘组脾淋巴细胞刺激指数显著（P＜0.05）高于阳性对照组，进一步表明黄党银淫甘能够刺激脾淋巴细胞的增殖。50 g/L黄党银淫甘组脾淋巴细胞刺激指数极显著（P＜0.01）高于25 g/L和100 g/L黄党银淫甘组，表明50 g/L黄党银淫甘组对刺激脾淋巴细胞增殖效果优于25 g/L和100 g/L黄党银淫甘组。

3 讨论

胸腺和法氏囊是鸡的中枢淋巴器官，又称初级免疫器官，是淋巴细胞等免疫细胞发生、分化和成熟的场所。胸腺是T细胞分化和成熟的场所，法氏囊是B细胞分化和成熟的场所。脾是鸡的外周淋巴器官，又称次级免疫器官，是成熟的T细胞和B细胞栖居、增殖和对抗抗原刺激产生免疫应答的场所。脾脏是机体最大的免疫器官，含有大量免疫细胞，是体液免疫和细胞免疫的重要部位，是产生抗体的主要器官[11]。淋巴细胞在免疫应答过程中起核心作用，淋巴细胞是免疫活性细胞，只有接受抗原刺激后才能分化增殖，产生特异性免疫应答，产生抗体或细胞因子[12]。淋巴细胞增殖是检测淋巴细胞免疫调节活性的重要指标[13]。

Rivas等[14]研究表明脾、胸腺和法氏囊等免疫器官的重量可用于评价雏鸡的免疫状态。Grossman[15]研究免疫器官指数对机体免疫力的影响，结果显示免疫器官指数与免疫功能强弱呈正相关。本研究在28日龄鸡胸腺、法氏囊和脾脏指数及脾淋巴细胞增殖均显著高于空白对照组，提示黄党银淫甘能刺激胸腺中T细胞和法氏囊中B细胞分化和成熟，使胸腺和法氏囊重量增大，提高胸腺和法氏囊指数；黄党银淫甘能够诱导脾中T细胞和B细胞活化和增殖，使脾的重量增大，提高脾指数；活化的淋巴细胞产生抗体或细胞因子，能够增强机体的体液免疫和细胞免疫。与文献结果相一致，但其作用机制还有待于进一步深入研究。

4 结论

黄党银淫甘可通过促进鸡胸腺、法氏囊和脾发育，刺激脾淋巴细胞增殖来提高机体的免疫功能。