一例猪链球菌与蓝耳病病毒混合感染的实验室诊断

2018-12-03陶巍夫王浩先黄培鑫倪宏波

现代畜牧兽医 2018年10期

陶巍夫，李超，王浩先，黄培鑫，倪宏波

（黑龙江八一农垦大学动物科技学院，黑龙江大庆 163000）

随着我国养殖行业的快速发展，各种疾病给猪场的发展造成了严重的制约。同时人们对食品及生命安全提出了更高的要求，也为养殖行业敲响了警钟，养殖场更应该注意养殖方式的合理化和规范化，给人们更多的保障。本文根据被送检的病猪，运用临床诊断、病理学剖检、细菌学和PCR技术进行诊断，确诊为链球菌和蓝耳病病毒混合感染，现将诊断过程汇总如下。

1 材料与方法

1.1 病料的采集安达市某规模化养猪场送检的患病仔猪，无菌条件下采集病死猪的肝脏、肺、脾脏、肾及小肠和淋巴结组织等病料进行后续诊断。

1.2 试验材料Marker DL 2000购自大连宝生生物工程有限公司，TIANamp Genomic DNA Kit DNA提取试剂盒购自TIANGEN公司，PCR Master Mix缓冲液，RNeasy Plus Mini Handbook RNA提取试剂盒购自QIAGEN公司，RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit反转录试剂盒购自MBI公司。其余试剂均为国产分析纯。

1.3 引物设计根据GenBank中已发表的猪普通蓝耳病（PRRS）和链球菌的基因序列及相关文设计特异引物。

表1 引物序列Table 1Peimer sequence

1.4 细菌分离培养无菌条件下采集仔猪肝、肺，在无菌台中取肝、肺部病变组织，均匀涂在血液营养琼脂培养基中，37℃下培养24 h后观察培养基中菌落形态。将灭菌的载玻片取出，擦干，随后滴加1滴生理盐水，挑取单菌落并使其在生理盐水中均匀分布，用酒精灯加热玻璃片背面并余热烘干，用革兰氏染色液进行染色，油镜观察。从培养基中挑取单菌落涂在另一个血液营养琼脂培养基中，37℃培养24 h后观察培养基中菌落形态，查看污染情况。取2个试管分别加入5 mL LB液体培养基，用10培养枪头从血液营养琼脂培养基中挑取单个菌落加入其中一个试管中，另一个作为对照组，放在摇床中，37℃培养24 h后，观察试管变化情况。

1.5 核酸的提取与 P C R鉴定

1.5.1 组织DNA和RNA提取按照TIANamp Geomic DNA Kit操作进行提取DNA；按照RNeasy Plus Mini Handbook RNA提取盒进行RNA提取，-20℃保存备用。

1.5.2 RNA反转录和PCR扩增按RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit反转录盒说明书操作步骤将病毒提取的RNA进行反转录，得到的cDNA在-20℃进行保存备用。用得到的DNA和cDNA为模板，猪圆环病毒（PCV）、猪普通致病性猪蓝耳病（PRRS）等特异性引物进行PCR反应扩增，取10 μL的扩增产物于1%琼脂糖凝胶电泳鉴定。

1.6 药敏试验将鉴定为猪普通致病性猪蓝耳病和链球菌混合感染的纯培养物用接种棒均匀涂布在鲜血培养基上，将药敏纸片（庆大霉素、卡那霉素、恩诺沙星等10种药物）分别贴于平皿中，37℃培养24 h，测定抑制菌圈直径大小，根据检测标准判定结果。

2 结果与分析

2.1 病理变化新生仔猪出现大量死亡，部分妊娠母猪出现部分流产，偶见木乃伊胎，感染后的母猪体温上升，新生仔猪则出现呼吸困难、生长缓慢、日渐消瘦、站立不稳、耳廓呈现紫蓝色出血斑点、皮肤苍白并有小疱疹，病猪四肢呈现八字形外张、站立不稳等临床症状。剖检时主要的病理变化有脾肿大、弥漫性间质性肺炎。病猪剖检可见腹腔积液、肠壁黏膜变薄出血、全身淋巴结肿大出血。病猪的皮肤多处出现紫红色的出血斑点。

2.2 细菌分离结果将小块肺脏组织均匀涂在血液营养琼脂培养基中进行培养，培养出的菌落为连续链状的菌落，挑取单菌落到血液营养琼脂培养基中纯化出单一菌落见图3，革兰氏染色后油镜下观察到革兰氏阳性球菌，其形态见图4。

图1 肺脏纤维样病变Fig.1Pulmonary fibrosis

图2 脾脏出血、肿大Fig.2The spleen is bleeding and swollen

图3 血液营养琼脂培养基菌落形态Fig.3Blood nutrition AGAR medium colony morphology

图4 革兰氏染色镜检结果Fig.4Results of gram stain microsco py

2.3 P C R检测结果

2.3.1 以细菌的DNA为模板，选用链球菌特异性引物进行PCR鉴定。PCR结果经琼脂糖凝胶电泳分析见图5，显示第3泳道条带为659 bp，与链球菌目的条带大小相符。

图5 细菌扩增结果Fig.5Bacterial amplification results

2.3.2 以患猪病毒的基因为模板，选用猪瘟病毒、圆环病毒以及蓝耳病病毒的特异性引物进行PCR鉴定。结果蓝耳病病毒为阳性，其余均为阴性。蓝耳病病毒PCR结果经琼脂糖凝胶电泳分析见图6，第4泳道的条带为373 bp，与蓝耳病病毒的目的条带相符。

图6 病毒扩增结果Fig.6V irus amplification results

2.4 药敏试验结果

表2 药敏试验结果Table 2The results of drug susceptibility

3 讨论

3.1 猪蓝耳病，别名猪神秘病、猪不孕与呼吸综合征、猪流产与呼吸综合征、猪繁殖与呼吸障碍综合征[1]。本病于1987年首次在美国的北卡罗来纳州、明尼苏达州、艾奥瓦州、印第安纳州的猪群中暴发流行。1991年6月荷兰学者首先从病料中分离出了病毒，并称其为Lelystad毒株。1996年，我国郭宝清等首次从我国流产胎猪中分离出蓝耳病病毒。由于该病原具有很强的致病性，蓝耳病被列为二类动物疫病，2008年，高致病性蓝耳病被我国农业部列为一类动物疫病。猪蓝耳病病毒易变异，具有遗传异质性，是全球猪健康和福祉最有负担的病原体[2]。蓝耳病不论什么品种、年龄、性别的猪，均可发病，其中妊娠母猪和1月龄内的仔猪尤为易感，本病呈地方流行性，无季节性[3]。猪蓝耳病一般传播方式为空气传播、性传播、血液接触以及垂直传播[4]。该病还可与其他猪病混合或继发感染发病。均为急性传染病，临床症状主要为新生仔猪大量死亡、体温升高、食欲废退、呼吸系统损伤。母猪妊娠后期发生流产、产木乃伊胎等病症。同时还可能引发高致病性的蓝耳病。高致病性猪蓝耳病是由猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒变异株引起的一种急性高致死性疫病，也是一种免疫抑制病［5］。高致病性蓝耳病还有发病率极高、传播迅速、发病急、发病时间长等特点。目前，针对此病尚无有效的治疗药物，通过免疫接种以及对症治疗等方法防控此类病症，还可以通过使用抗生素减少继发感染，以达到减少养殖行业的损失以及保障我们的人身安全。

3.2 猪链球菌病是由多种致病性链球菌混合感染引起的一种人畜共患病。早在1968的荷兰和丹麦就有报道人感染猪链球菌的病例，目前全球已有400多余例人感染病例。我国在1998年的江苏以及2005年的四川曾出现多例病例，严重的甚至导致死亡。现在每年还存在散发病例。链球菌的易感宿主较多，鸡、兔、猪、马、牛、羊等均为常见宿主。猪不论其品种、性别和年龄均可感染。链球菌病发病有时会呈现明显的季节性，但临床猪发病则不呈现明显的季节性，在持续高温时会出现大面积发病的情况。同时链球菌病的发病需要经诸多因素的诱导，其中不仅有环境因素、人为因素，还有遗传因素。当饲养条件差或温度忽高忽低时，动物免疫力下降就可能造成此病的爆发。该病可通过种群的直接或间接接触发病，发病急，难以控制。其中，主要传染源为患病和病死动物。链球菌病的临床表现多样，可表现为各种化脓创或败血症，也可表现为各种局部感染，同时伴有一些常见的临床症状。如患有急性败血症的病猪会出现触之尖叫、皮肤呈现蓝紫色、流鼻液、便秘或倒地不起等症状。患有脑膜炎的病猪临床症状有食欲减退、精神萎靡、出现转圈运动、触碰身体时发生抽搐、口吐白沫、四肢呈游泳状滑动等。当患有亚急性或最急性型时会患关节炎、乳房炎等。患有关节炎的仔猪出现步态僵硬、肌肉震颤、四肢猛烈滑动死亡。淋巴结脓肿的猪则出现呼吸困难、体温升高、颈部等处触之坚硬、有热痛等症状，并可能伴有神经症状。由于本病的发病特点，抗菌类的药物可以有效地针对本类病进行治疗，但是细菌的耐药性不断增强，为本病的治疗增加了难度。链球菌病具有一定的传染性，所以给现在的行业增添了风险，针对此病应该尽早发现，尽早确诊，尽早治疗，以降低养殖中的风险。

3.3 虽然至今还没有治疗猪繁殖与呼吸障碍综合征的有效药物，但是致病性猪蓝耳病灭活疫苗已被研制出，且经过大量的试验证明该疫苗安全有效，疫苗的防护效率可以达到80%左右[6]。为避免境外传入，引进猪种时有关部门要严格进行检疫，并进行隔离观察，拒绝从发生过蓝耳病的猪场购买猪种。如果发生高致病蓝耳病，应立刻上报疫情，尽快封锁猪场，对患病猪进行全面扑杀、销毁，控制疾病的扩散和蔓延。严格执行全进全出、自繁自养的管理制度，对畜舍经常清扫消毒，保持通风，增加环境舒适度，并且要对饲养工具进行常态消毒处理。

3.4 目前，国内外已经研究出弱毒疫苗以及灭活疫苗。国内的变异毒株蓝耳病疫苗包括JXA1-R、TJMF92和Hu-F112，经典的毒株主要有CH1-a和R98等，弱毒疫苗可产生体液免疫以及细胞免疫，效果明显，能够保证不出现严重临诊症状。对于健康的猪群应及时接种疫苗，提高抵抗力。目前市面的疫苗种类多样，要根据区域流行毒株进行正确选择[7]，由于蓝耳病传播迅速，流行范围广，并且该病的病毒抗原多样，因此该病不能完全依赖疫苗注射。一般情况下对病畜进行紧急的疫苗接种是有效的，尤其是发病早期并准确诊断时，但不能长期依赖紧急的免疫措施，要做好综合的防范措施和预防免疫。免疫是预防的关键，防止猪圆环病毒、猪瘟病毒、蓝耳病病毒等病毒性疾病与巴氏杆菌、大肠杆菌、链球菌等细菌性疾病的混合感染[8]。

3.5 预防链球菌病的常规措施，包括平时对饲养环境的全面消毒、科学饲喂、建立良好舒适的饲养环境，并加以适当的运动。平时要注意牲畜全进全出、自繁自养的模式。提高动物的抗病能力，防止并发及继发感染，可以有效地预防该病的传播[9]。

3.6 在疾病流行的季节要提前做好免疫，制定健全的管理制度，科学执行，以免疾病爆发流行。预防链球菌病应采如下取措施。

3.6.1 做出正确诊断，制定相应的防护措施以及预防办法，对病畜进行紧急隔离。禁止疫畜动物群体的活动，紧急上报相关的部门及临近的县、乡。

3.6.2 对病猪所用的饲养工具进行全面的消毒处理，避免病毒的传播，并将病畜的粪污进行合理处理等。

3.6.3 对猪圈要进行严格、彻底的清毒，这样可控制传染源，避免养殖场出现较大的疫情[10]。对全体动物进行全面的检疫，如发现有临床症状的病畜紧急进行隔离或淘汰。