胶原诱导与抗原诱导C57BL/6小鼠类风湿关节炎造模的比较研究

范凯健，吴 菁，王婷玉*

(1.上海交通大学医学院附属第九人民医院药剂科，上海 200011； 2.上海市宝山区中西医结合医院药剂科，上海 201901)

类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis，RA)是一种慢性、进行性的自身免疫系统疾病，其特征主要是滑膜的长期慢性炎症，从而造成软骨以及骨关节结构的逐渐破坏。RA影响超过1%的人群，并导致患者的生活质量明显下降[1]。RA具有多样的临床症状，因此许多实验动物模型试图模仿这种疾病的多种临床特征。目前，研究者已经开发了许多关节炎模型，并且这些模型成为阐明RA疾病发展过程和开发新药的非常有用的工具[2-4]。许多转基因小鼠需要在C57BL/6小鼠背景下繁殖，因此在此小鼠背景下的疾病造模研究就显得尤为重要。转基因小鼠的研究将更广泛地揭示疾病的分子机制，并且能为可能的治疗方法提供验证。本实验将研究C57小鼠背景下，胶原诱导性关节炎(collagen-induced arthritis，CIA)和抗原诱导的关节炎(antigen-induced arthritis，AIA)的造模情况。

注：A：两侧股骨头对应的外部皮肤皮内注射；B：膝关节腔内注射。图1 AIA模型造模注射部位Note. A: Intradermal injection to the external skin corresponding to the femoral head on both sides. B: Intra-articular injection of the knee joint.Figure 1 Injection sites for modeling of the AIA model

1 材料和方法

1.1 实验动物

AIA组8周龄SPF级雄性C57BL/6小鼠(体重：20～25 g)21只，CIA组10～14周龄SPF级雄性C57BL/6小鼠(体重：25～30 g)21只，由上海交通大学医学院附属第九人民医院动物房所提供[SCXK (沪) 2013-0016]。常规饲养于拥有独立通气笼盒(individual ventilated cages，IVC)的动物房，12 h光照和夜循环，温度(22±2)℃，湿度50%～60%[SYXK (沪) 2016-0016]。实验期间，遵循3R原则给予实验动物人道主义关怀。动物实验的开展取得了上海交通大学医学院附属第九人民医院实验动物伦理委员会批准(编号：HKDL[2017]207)。

1.2 主要试剂与仪器

4 mg/mL鸡II型胶原,Chondrex公司，批号170376；5 mg/mL(Chondrex公司，批号170670)和10 mg/mL(Chondrex公司，批号170666)的完全弗氏佐剂(Complete Freund’s Adjuvant,CFA)；冰醋酸溶液；甲基化的牛血清白蛋白(methylated bovine serum albumin,mBSA)；磷酸盐缓冲盐水(phosphate buffer saline,PBS)。游标卡尺(无锡锡丰有限公司)，电子天平(上海浦春计量仪器有限公司)，微量进样器(上海高鸽工贸有限公司)。

1.3 实验方法

1.3.1 AIA造模方法

选用8周龄雄性C57BL/6小鼠在第0天时，将100 mg mBSA溶解于50 μL PBS中，再与50 μL CFA混合乳化，最后在两侧股骨头对应的外部皮肤皮内注射(图1A)。在第7天时，同样的剂量在尾根部皮内多点注射。在第21天时，将10 μg mBSA溶于5 μL PBS中后注射于左侧膝关节腔内，右侧膝关节腔内则注射同等剂量的PBS(图1B)。

1.3.2 CIA造模方法

选用10～14周龄雄性C57BL/6小鼠，将4 mg/mL鸡的II型胶原冰醋酸溶液，与6.67 mg/mL的CFA按照1: 1混合乳化后分别在第0天和第14天于小鼠尾根部皮内多点注射0.1 mL。

1.3.3 膝关节、踝关节的肿胀度和体重的监测

对于CIA模型，从第0天开始，用电子称对小鼠进行称重，用游标卡尺测量踝关节和膝关节的直径，每周测量两次，一共测量四周。对于AIA模型，从第0天开始，用电子称对小鼠进行称重，用游标卡尺测量膝关节的直径，连续测量一周。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 CIA模型

表1 CIA与AIA模型造模比较

从图2A可以看出，模型组相对于正常组，体重会明显减轻，且在第7、12和17这三天的结果差异有显著性。在此次实验中，正常组3只，模型组18只(表1)。模型组中5只出现严重关节炎症状，2只出现轻微关节炎症状，1只第一次造模后死亡。5只出现严重关节炎症状的小鼠中，只有1只四肢都出现严重的关节炎症状。从图2C可以看出，第7天开始，模型组小鼠踝关节开始出现关节炎症状，且在第17天达到高峰后慢慢减轻。从图2B可以看出，模型组与正常组膝关节的差异不明显，只有在第20天才出现明显差异。综上，CIA模型关节炎症状最先累及踝关节(图3)，后迁延至膝关节，且症状持续时间较久。

注：A：体重；B：膝关节肿胀度；C：踝关节肿胀度。与正常组比较，*P < 0.05，**P < 0.01。图2 CIA模型组与正常组比较Note. A: Body weight. B: Swelling degree of the knee joint. C: Swelling degree of the ankle joint. Compared with the normal group,*P < 0.05,**P < 0.01.Figure 2 Comparison of the CIA model and normal groups

图3 CIA模型造模成功后小鼠后爪Figure 3 Mouse hind paw after successful CIA model establishment

2.2 AIA模型

从图4A可以看出，模型组与正常组体重差异无显著性。在此次实验中，正常组3只，模型组18只(表1)。其中模型组10只出现严重的关节炎症状，7只出现轻微的关节炎症状，1只加强造模前死亡。图4B可以看出，模型组从第1天开始出现严重的关节炎症状，直至第3天开始慢慢消退。从图4C可以看出，模型组注射PBS的右膝关节与正常组无明显差别。综上，AIA模型关节炎症状主要是在膝关节(图5)，且维持较短。

注：A：体重；B：膝关节肿胀度(左)；C：膝关节肿胀度(右)。与正常组比较，*P < 0.05，**P < 0.01。图4 AIA模型组与正常组比较Note. A: Body weight. B: Swelling degree of the knee joint (left). C: Swelling degree of the knee joint (right). Compared with the normal group,*P < 0.05,**P < 0.01.Figure 4 Comparison of the AIA model and normal groups

图5 AIA模型造模成功后膝关节Figure 5 Knee joint after successful AIA model establishment

3 讨论

CIA是在1980年首次由CII诱导的小鼠模型[5]，从此成为关节炎中使用最广泛的关节炎模型之一。通过免疫接种，在遗传易感性小鼠品系中极易引发CIA。在CIA模型中，小鼠会出现与RA相似的慢性骨侵蚀和滑膜炎症[5]。但该模型与RA之间最显著的差异在于CIA中不存在类风湿因子，且实验性疾病一般是单相的。CIA经典模型是DBA/1(H-2q)小鼠品系，在我们团队以前的实验中此品系小鼠造模成功率100%。本实验中，我们是在C57BL/6背景下造CIA模型。由于B6小鼠的主要组织相容性(major histocompatibility，MHC)的特异性，导致较低的发病率和较高的差异性[6]。对于在B6背景下CIA造模的研究，国外已经有多支团队研究过。在Ikic[7]等人的实验中，是选用的8～10周龄小鼠且加强注射选在第21天，加强时选用不完全弗氏佐剂(complete Freund’s adjuvant，IFA)而非CFA。他们通过对大约200只小鼠造模，研究发现，造模成功率在50%左右。在我们团队的实验中，B6小鼠的造模成功率是41%，与国外团队成功率差不多，但还是远低于DBA小鼠的造模成功率。且B6小鼠的关节炎严重程度差异性大，一般只有后爪肿胀，而在DBA背景下造模，基本都会出现四肢严重的关节炎症状。由此可见，B6背景下的CIA造模差异性较大，无法出现比较一致的关节炎症状。

AIA是通过mBSA免疫动物并局部诱发关节炎的产生。它是一种由T细胞介导的关节炎症，其受累关节的组织病理学与RA有许多相似之处。但由于炎症局限在膝关节周围，AIA并不是RA的一个完整模型。由于组织学的差异性，AIA引起的炎症相对于RA引起的滑膜炎症，炎症过程更加快速但结缔组织也更快速的分解[8]。在本次实验中，膝关节从第一天开始就出现严重的关节炎症状，并持续三天，后症状逐渐减轻。在此次实验中，AIA的造模成功率为100%，明显高于CIA的造模成功率。mBSA是一种高密度阳离子蛋白质，能被软骨表面所吸附，因此可以延长其关节炎症状[9]。此外，膝关节腔内有限的空间也能导致mBSA诱发严重的关节炎。综上，B6背景下的AIA造模成功率高，严重程度高，但关节炎症状维持时间短，不利于研究RA的慢性关节炎机制。虽然AIA模型不是RA的完整模型，但对研究关节炎局部细胞之间的相互作用还是很有价值的[10]。

在B6背景下，CIA的造模成功率低，且差异性较大，但后爪关节炎症状严重且维持时间久。CIA模型在免疫学和病理学上更类似于RA，因此适合研究RA对机体整体的影响。而AIA作为单侧关节炎。优点是关节炎的确切起点，100%的发生率和重现性好。因此AIA模型适合于关节疼痛的研究。两种模型之间各有优缺点，适合不同的实验需求。通过对B6背景下两种模型的相互比较，为了更全面的研究RA的致病机制，可能更适合在后续的转基因小鼠身上造CIA模型。