4T1炎性乳腺癌细胞接种联合皮质酮注射诱导乳腺癌并发抑郁症小鼠模型的研究

杨 蕙，孟 盼，杨 琴，韩远山，凌 佳，杜 青，赵洪庆，王宇红*

(1.湖南中医药大学第一附属医院中心实验室，长沙 410007； 2.湖南中医药大学中药粉体与创新药物省部共建国家重点实验室培育基地，长沙 410208； 3.湖南省中医药研究院，长沙 410006)

乳腺癌是世界范围内最常见的女性恶性肿瘤[1]，且比其他类型的癌症更加能影响患者的精神与情绪[2]。Shakeri等[3]对乳腺癌患者测评后发现，高达有69.4%的患者表现出了重度抑郁症。而在中国，调查显示乳腺癌术后发生抑郁症的比例为23.4%，其中重度抑郁症比例达25%[4]。抑郁症可严重影响乳腺癌的治疗及预后[5]，开展乳腺癌并发抑郁症(breast cancer related depression，BCRD)的防治研究已迫在眉睫。但是文献调研后发现，目前有关BCRD的研究主要集中在临床，而动物实验研究少见，严重阻碍了BCRD相关研究的进展。本实验拟采用4T1炎性乳腺癌细胞接种联合21 d皮质酮注射，建立乳腺癌并发抑郁症小鼠模型。并通过对比抑郁症小鼠和乳腺癌小鼠，从行为学、瘤形态和标记物含量等角度，对该模型进行初步评价，以期为乳腺癌并发抑郁症实验研究提供可靠的动物模型参考。

1 材料和方法

1.1 实验动物

SPF级BALB/c雌性小鼠40只，4～6周龄，18～22 g，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司，实验动物生产许可证号：SCXK (湘) 2013 - 0004，合格证号：43004700025656。动物自购买之日起即饲养于湖南中医药大学第一附属医院SPF动物房内[SYXK (湘) 2015-0003]，并在光暗周期为12 h/12 h环境中适应性喂养5 d，温度为20℃～26℃，湿度为40%～70%，自由获取食物与水。

1.2 主要试剂与仪器

皮质酮购自索莱宝生物公司；RPMI培养基、胰酶购自HyClone；胎牛血清购自杭州四季青生物工程材料有限公司；DMSO购自上海蓝润化学有限公司；肿瘤抗原CA153、糖类抗原CA125、癌胚抗原(CEA)、5-羟色胺(5-HT)、多巴胺(DA)、去甲肾上腺素(NE)的ELISA试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司。自动双重水蒸馏器购自上海健强玻璃仪器有限公司；MK3型酶标仪购自美国Thermo公司。

1.3 实验方法

1.3.1 4T1炎性乳腺癌细胞的培养

4T1炎性乳腺癌元代细胞株购买于上海科学院细胞库，在显微镜下观察细胞生长状态，用0.22 μm过滤器过滤细胞，弃掉培养液，加入适量PBS轻轻吹打细胞，1500 r/min，8 min离心，加入含有RPMI培养液(内含10%胎牛血清，1%双抗)10 mL，转移至25 cm2培养瓶中，放入37℃恒温培养箱中，培养2 d后，观察细胞生长状态，若长至80%～90%，弃去培养液，用适量PBS洗1次，弃PBS，加入2 mL胰酶，使其与培养板细胞充分接触，培养箱中消化2 min后，显微镜下观察细胞消化情况，若大部分细胞未变圆，用移液枪轻轻吹打细胞，使80%～90%细胞消化，加入2倍胰酶体积的培养液终止消化，将细胞转移至5 mL离心管中，1500 r/min，8 min，4℃离心，弃去培养液，加入适量PBS轻轻吹打细胞，使其完全成细胞悬浮状态，1500 r/min，8 min，4℃离心，弃PBS，加入培养液，将细胞浓度调整为106个/mL，置于培养箱中培养，待细胞生长至对数期时，将细胞消化收集，用PBS将细胞吹打成单个悬浮状态，并将其浓度调整为107个/mL。

1.3.2 动物模型制备

以BALB/c小鼠为造模对象，在其腋下接种0.1 mL的107个/mL 4T1炎性乳腺癌细胞，用以建立乳腺癌小鼠模型。采用背部皮下注射皮质酮混悬液30 mg/kg(每300 mg皮质酮用5 mL DMSO预溶解，随后加入95 mL生理盐水)，连续注射21 d，用以制备抑郁症小鼠模型。而乳腺癌并发抑郁症小鼠模型则是在接种4T1炎性乳腺癌细胞7 d后，在其背部皮下注射皮质酮混悬液，连续注射21 d。实验中全程按照实验动物使用3R原则给予人道主义关怀，IACUC号：HN-LL-KY-2016-004-01。

1.3.3 动物分组

小鼠适应性喂养5 d后，将动物按体重随机分为2组：一组腋下接种4T1炎性乳腺癌细胞，成模的小鼠按糖水消耗随机分为2组：乳腺癌组和乳腺癌并发抑郁症组，未注射4T1炎性乳腺癌细胞的小鼠按糖水消耗分为2组：空白组和抑郁症组，每组10只。

1.3.4 瘤重、瘤体积指标检测

小鼠禁食禁水24 h后处死，将乳腺肿瘤剥离下来，并去除多余的毛发，称量其瘤重，抑瘤率=(对照组平均质量-实验组平均质量)/对照组平均质量× 100%。并用游标卡尺量取其长、宽、高三径，计算体积V=(长×宽2)/2。

1.3.5 行为学检测

(1)糖水偏好：糖水偏好度反应了抑郁动物快感缺失的症状。将小鼠饲养于单笼内，禁食禁水12 h后，给予事先称好质量的1%蔗糖水和蒸馏水各一瓶，1 h后取出水瓶，称量出剩余的蔗糖水与蒸馏水的重量。糖水消耗总共测量4次，时间分别为抑郁造模前，造模后1、2、3周。糖水消耗度=糖水消耗量/(蒸馏+糖水消耗量)× 100%。

(2)旷场实验：小鼠禁食不禁水24 h后，将动物放入箱内底面中心，实验箱规格为50 cm × 50 cm × 40 cm。适应30 s后，观察并记录动物在3 min内双后肢跨越方格的个数(水平运动)与前肢腾空或攀爬墙壁的次数(垂直运动)。实验在无明显光源的环境中进行，观察完毕擦拭箱内壁及底面，以免上次动物余留的信息影响下次测试结果。

(3)新奇摄食实验：小鼠禁食不禁水24 h后，将动物面向箱壁从同一位置放入实验箱中，实验箱规格为50 cm × 50 cm × 40 cm，箱中心放入适量等体积食物，适应30 s后，观察并记录小鼠5 min内首次咀嚼食物的时间。实验在无明显光源的环境中进行，观察完毕擦拭箱内壁及底面，以免上次动物余留的信息影响下次测试结果。

1.3.6 肿瘤标志物、单胺类神经递质含量的检测

小鼠禁食禁水24 h后取血，4℃静置2 h后，3000 r/min，10 min离心，取上清液，置于液氮中速冻，后转移至超低温保存箱备用。将保存备用的血清或血浆样本在室温下解冻，严格按CA153、CA125、CEA、5-HT、DA、NE的ELISA试剂盒操作检测血中各指标的含量。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 乳腺肿瘤瘤重和瘤体积的变化

肿瘤离体后可见，乳腺肿瘤呈不规则的长椭圆形、球形或结节形，外表有完整的包膜包被，颜色为肉红色，有丰富的血管包裹，部分肿瘤分化生长成多个瘤体，或者有黑色的坏死区，质硬。肉眼观看可见，乳腺癌皮质酮组小鼠的肿瘤大于或基本等于乳腺癌组小鼠的肿瘤。结果见图1。通过数据统计分析可知，与乳腺癌组比较，乳腺癌皮质酮组瘤重、瘤体积均升高，差异有显著性(P< 0.05)。结果见表1。

2.2 肿瘤标志物含量变化

与正常对照组比较，抑郁症组肿瘤标志物CA153，乳腺癌组CA153和CA125，乳腺癌皮质酮组小鼠肿瘤标志物CA153、CA125和CEA均明显上升(P< 0.01或P< 0.05)。与抑郁症组比较，乳腺癌皮质酮组CA153、CA125和CEA明显升高(P< 0.01)。与乳腺癌组比较，乳腺癌皮质酮组CA153、CA125和CEA表达差异无显著性。结果见表2。

2.3 行为学变化

2.3.1 小鼠快感缺乏的变化

与正常对照组比较，造模第二周抑郁症组和乳腺癌皮质酮组糖水消耗明显降低，差异有显著性(P< 0.05)；第三周时，抑郁症组、乳腺癌组和乳腺癌皮质酮组糖水消耗明显下降(P< 0.01或P< 0.05)。与乳腺癌组比较，乳腺癌皮质酮组造模第三周的糖水消耗显著减少(P< 0.05)。结果提示，乳腺癌小鼠在接受了21 d皮质酮注射后，明显存在快感缺乏症状。结果见表3。

注：A：乳腺癌组；B：乳腺癌皮质酮组。图1 各组小鼠乳腺肿瘤肉眼形态特征Note. A: Breast cancer group; B: Breast cancer with corticosterone group.Figure 1 Morphological characteristics of mammary gland tumors in each group of mice

组别Groups瘤重(g)Tumor weight瘤体积(mm3)Tumor volume正常对照组Control group00乳腺癌组Breast cancer group0.919±0.4396.93±479.64乳腺癌皮质酮组Breast cancer with corticosterone group 1.12±0.38#1204.16±619.60#

注：与乳腺癌组比较，#P< 0.05。

Note. Compared with the breast cancer group,#P< 0.05.

表2 各组小鼠血浆乳腺癌相关标志物的含量±s，n=10)

注：与正常对照组比较，*P< 0.05，**P< 0.01；与抑郁症组比较，##P< 0.01。

Note. Compared with the control group,*P< 0.05,**P< 0.01. Compared with the depression group,##P< 0.01.

表3 乳腺癌并发抑郁症小鼠糖水消耗的变化±s，n=10，%)

注：与正常对照组比较，*P< 0.05，**P< 0.01；与乳腺癌组比较，▲P< 0.05。

Note. Compared with the control group,*P< 0.05,**P< 0.01. Compared with the breast cancer group,▲P< 0.05.

2.3.2 小鼠自主行为、探究和环境恐惧意识的变化

与正常对照组比较，抑郁组、乳腺癌皮质酮组小鼠经过格子数、直立次数明显下降(P< 0.05)，乳腺癌组仅经过格子数明显下降，差异有显著性(P< 0.05)；抑郁组、乳腺癌组、乳腺癌皮质酮组小鼠首次摄食所耗时间明显上升，差异有显著性(P< 0.05)。与抑郁症组比较，乳腺癌皮质酮组小鼠旷场实验经过格子数和直立次数均下降，差异有显著性(P< 0.01或P< 0.05)。与乳腺癌组比较，给予皮质酮组后癌症小鼠经过格子数、直立次数明显降低，首次摄食所耗时间明显上升，差异有显著性(P< 0.01或P< 0.05)。提示，乳腺癌小鼠在接受皮质酮造模后，缺乏在新奇环境中的自主行为、探索与摄食欲望，存在饥饿与对新环境恐惧的矛盾冲突。结果见表4。

2.4 单胺类神经递质含量的变化

与正常对照组比较，抑郁组和乳腺癌皮质酮组小鼠血液中单胺类神经递质NE、DA和5-HT均明显下降，差异有显著性(P< 0.01)，乳腺癌组单胺类神经递质无明显变化；与抑郁症组比较，乳腺癌皮质酮组NE、DA和5-HT明显降低(P< 0.01或P< 0.05)；与乳腺癌组比较，乳腺癌皮质酮组仅NE、DA明显降低(P< 0.01)。结果见表5。

3 讨论

2015年中国30～59岁女性的乳腺癌患病率位居癌症首位[6]。抑郁是乳腺癌病人普遍存在的一种心理状态，手术方式、家庭支持、收入水平、婚姻状况和受教育程度等因素均会影响乳腺癌患者抑郁的发生[7]。但是，目前乳腺癌并发抑郁症的针对性治疗明显不足，其并发机制也尚未见阐明。因此，建立一种乳腺癌并发抑郁症小鼠模型将有利于疾病防治的开展。

首先，本实验选用了经典的BABL/c小鼠4T1炎性乳腺癌细胞接种的方式建立了乳腺癌模型，该模型被认为与人类乳腺癌具有相似的生物学特性，是研究乳腺癌的理想模型[8]。其次，经典的抑郁症造模方法有应激造模、手术造模以及遗传性造模等，由于本实验已经选定了BABL/c小鼠，并进行了乳腺癌细胞接种，为了避免造模过程中物理性损伤乳腺癌瘤体，并减少动物的死亡率，故实验选用慢性注射皮质酮进行抑郁造模[9]。

表4 乳腺癌并发抑郁症小鼠旷场实验、新奇摄食实验的变化±s，n=10)

注：与正常对照组比较，*P< 0.05；与抑郁症组比较，#P< 0.05，##P< 0.01；与乳腺癌组比较，▲P< 0.05，▲▲P< 0.01。

Note. Compared with the control group,*P< 0.05. Compared with the depression group,#P< 0.05,##P< 0.01. Compared with the breast cancer group,▲P< 0.05,▲▲P< 0.01.

表5 各组小鼠血清中单胺类神经递质的含量±s，n=10)

注：与正常对照组比较，**P< 0.01；与抑郁症组比较，#P< 0.05，##P< 0.01；与乳腺癌组比较，▲▲P< 0.01。

Note. Compared with the control group,**P< 0.01. Compared with the depression group,#P< 0.05,##P< 0.01. Compared with the breast cancer group,▲▲P< 0.01.

CA153是临床上应用于乳腺癌的特异血清肿瘤标志物，在乳腺癌的诊断、疗效检测及预后判断等方面应用比较广泛。CA153作为一种糖抗原，可在乳腺癌发生时，从癌细胞膜上分离出来，并释放到血液中。而CA125作为一种跨膜糖蛋白，在机体正常的情况下，是无法进入到血清中的，只有当浸润性肿瘤细胞破坏组织结构时，其才会释放入血。皮亚平等[10]认为，CA125和CA153的联合检查在乳腺癌的确诊过程中具有重要的角色，可大大提高疾病诊断的准确率。此外，CEA是一种具有人类胚胎抗原决定簇的酸性糖蛋白，其在晚期乳腺癌和发生转移的患者中阳性率较高。刘珍等[11]通过临床研究发现，IV期乳腺癌患者血清中CEA和CA153水平明显高于III期，且以上两者表达阴性组化疗有效率和存活率均明显高于阳性组。由此可见，CA125、CA153、CEA在乳腺癌的诊断、治疗效果、预后评估等方面均可作为重要参考依据。因此，本实验采用以上三者作为乳腺癌并发抑郁症小鼠模型的评价指标，结果可见，给予乳腺癌小鼠皮质酮后，小鼠血浆中CA125、CA153、CEA均显著增加。此外，通过对乳腺肿瘤的瘤重和瘤体积分析可知，乳腺癌皮质酮组小鼠的瘤重和瘤体积比乳腺癌小鼠显著增加，故推测抑郁可能会加重乳腺癌的发生发展。

目前，针对啮齿类动物的行为学研究已经发展的比较成熟，常见的行为学检测方法也是围绕奖赏、探索、绝望等多个角度展开。其中，奖赏方面主要包括糖水偏好行为检测、颅内自我刺激实验等，而探索方面主要包括新奇摄食实验、旷场实验、高架十字迷宫实验等，绝望方面则是强迫游泳实验和悬尾实验等[12]。由于模型小鼠腋下靠近背部有一个明显的瘤体，且每个小鼠瘤的大小并不一致，对小鼠的游泳和悬尾等行为有明显干扰，会导致相应的实验结果误差较大。故本实验主要针对模型小鼠奖赏和探索两个方面进行了研究，选择了糖水消耗实验、旷场实验和新奇摄食实验。与此同时，本实验还选取了抑郁症发生的典型指标，单胺类神经递质5-HT、NE、DA，与行为学指标一些，协同评价各组大鼠的抑郁症状态。结果发现，乳腺癌小鼠在造模第3周开始表现出快感缺失，其对于环境的探索欲望下降，但体内单胺神经递质含量没有显著下降，即抑郁程度弱于抑郁症组小鼠。而乳腺癌小鼠在接受了慢性皮质酮注射后，其奖赏行为和探索行为均表现出明显变化，体内单胺神经递质显著减少，抑郁程度较抑郁组小鼠更为严重。故实验推测，乳腺癌小鼠在没有接受抑郁造模时，虽然表现出了部分抑郁样行为，但此时个体差异较大，很难开展乳腺癌并发抑郁症的研究工作。只有对其施加一定的应激措施，诱使其发展为乳腺癌并发抑郁症小鼠后，其有关抑郁的行为学表现和神经递质水平才会比较稳定，更适合进行下一步的研究工作。

4T1炎性乳腺癌细胞接种联合皮质酮注射诱导的乳腺癌并发抑郁症小鼠不仅具备了典型的抑郁样症状和明显的神经递质变化，而且在乳腺癌标志物方面表现出明显异常，可作为一种乳腺癌并发抑郁症动物模型，被用于该疾病的发病机制研究或是药物防治研究，具有较好的参考价值。