多指标综合评分法结合Box-Behnken响应面法优选心痛宁胶囊醇提工艺△

刘怡，如扎·哈布都拉，李露，王萍，2，孟瑶，李玉婷，依孜提·帕力哈提，张丽娟，聂继红，2*

(1.新疆医科大学，新疆 乌鲁木齐 830011；2.新疆医科大学第四临床医学院，新疆 乌鲁木齐 830000)

心痛宁胶囊是国医大师新疆医科大学第四临床医学院沈宝藩教授三十多年来治疗心血管疾病的临床经验方，处方由川芎、当归、厚朴等多味药材组成，对治疗痰瘀互结型冠心病疗效显著。方中含有川芎、当归、厚朴等多味药材，具有扩张血管，抗血小板聚集等多重药理作用[1-5]。原方以传统汤剂方式服用，将其开发成胶囊剂则可以克服汤剂服用剂量大、口感差、储存携带不便等不足，最大程度地方便患者。

Box-Behnken响应面法是采用多元二次方程来拟合因素和效应值之间的函数关系，通过对回归方程的分析来寻求最佳工艺参数，解决多变量问题的一种统计方法[6]。本课题通过多指标综合评分，运用Box-Behnken响应面法优选心痛宁胶囊醇提工艺，为该课题的后续研究开发奠定基础。

1 仪器与试药

1.1 仪器

高效液相色谱仪(Waters-2695)；紫外可见分光光度计(Cintra 20)；SI-234电子天平[丹佛仪器(北京)有限公司]；AGL-135电子天平[梅特勒-托利多仪器(上海有限公司)]；SK250LHC超声清洗器(上海科导超声仪器有限公司)。

1.2 试药

阿魏酸对照品(批号：110773-201012)、厚朴酚对照品(批号：110729-200310)和厚朴酚对照品(批号：0730-200206)、芦丁对照品(批号：100080-200707)(中国食品药品检定研究院)；冰醋酸为分析纯；甲醇、乙腈为色谱纯；水为超纯水。

川芎、当归、厚朴等药材饮片均购自于亳州市中正药材饮片有限公司，由新疆医科大学第四临床医学院药学部提供，经李永和主任中药师鉴定，结果均符合2015版《中华人民共和国药典》一部各项有关规定。

2 方法与结果

2.1 阿魏酸、厚朴酚以及和厚朴酚的含量测定

2.1.1 色谱条件与系统适用性实验 色谱柱Symmetry C18(150 mm4.6 mm，5m)；十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，流动相A和B分别为乙腈和1%冰醋酸溶液，按表1所示进行梯度洗脱。阿魏酸及厚朴酚类检测波长分别为318、298 nm，体积流量为1.0 mL·min-1，进样量为10L，柱温为30 ℃[7-10]。

表1 梯度洗脱

2.1.2 对照品溶液的制备 精密称取适量阿魏酸、厚朴酚、和厚朴酚对照品，加色谱甲醇制成质量浓度分别为0.01、0.26、0.38 mg·mL-1的混合储备液。

2.1.3 供试品溶液的制备 称取处方中拟采用醇提的药材，加60%乙醇10倍量，加热回流提取2次，每次1 h，合并提取液，经纱布滤过，滤液离心60 min后取上清液10 mL，蒸干，干膏加适量色谱甲醇溶解，定容到5 mL容量瓶刻度，经0.45m的微孔滤膜滤过，即得。

2.1.4 阴性样品溶液的制备 称取处方中除当归、川芎、厚朴以外的中药材，按2.1.3项下方法制备阴性样品溶液。

2.1.5 线性范围考察 精密吸取2.1.2项下混合储备液1、2、3、4 mL用色谱甲醇定容于5 mL量瓶中，得到不同浓度的溶液，同时取混合储备液，在2.1.1项色谱条件下测定。以峰面积为纵坐标(Y)，以浓度为横坐标(X)进行线性回归，得到回归方程，结果见下表2。

表2 回归方程和相关系数

2.1.6 精密度试验 精密吸取2.1.2项下对照品溶液，按2.1.1项色谱条件进样10 μL，连续进样6次，测定得阿魏酸、厚朴酚、和厚朴酚峰面积的RSD值分别为1.70%、0.77%、0.23%，表明仪器的精密度良好。

2.1.7 重复性试验 按处方比例，称取6份同一批醇提药材，按2.1.3项下制备供试品溶液，在2.1.1项色谱条件下进样10 μL，测定得阿魏酸、厚朴酚、和厚朴酚峰面积的RSD值分别为0.63%、1.06%、1.09%，表明该方法重复性良好。

2.1.8 稳定性试验 精密吸取同一供试品溶液，在2.1.1项色谱条件下分别于制备后的第0、6、8、12、24、48 h进行测定，进样10 μL后得到阿魏酸、厚朴酚、和厚朴酚峰面积的RSD值分别为0.70%、1.13%、1.58%，结果表明，供试品溶液在48 h内稳定性良好。

2.1.9 加样回收率试验 取已知含量的待测溶液6份，分别加入阿魏酸、厚朴酚、和厚朴酚对照品0.20、1.34、1.27 mg，按2.1.3项下制备供试品溶液，按2.1.1项的色谱条件进样10 μL测定，结果平均加样回收收率分别为95.46%、103.92%、103.13%，RSD分别为2.24%、2.82%、0.57%，结果表明本品的加样回收率良好。

注：A.混合对照品溶液(318 nm)；B.混合对照品溶液(298 nm)；C.供试品溶液(318 nm)；D.供试品溶液(298 nm)；E.缺阿魏酸阴性样品(318 nm)；F.缺厚朴酚及和厚朴酚阴性样品(298 nm)；1.阿魏酸；2.和厚朴酚；3.厚朴酚。图1 心痛宁胶囊中阿魏酸、厚朴酚、和厚朴酚的HPLC图

2.2 总黄酮的含量测定

2.2.1 对照品溶液的制备 精密称取芦丁对照品适量，加无水乙醇充分溶解，作为对照品储备液(质量浓度为2.001 mg·mL-1)。

2.2.2 供试品溶液的制备 按拟定的实验方案进行提取，备用。

2.2.3 最大吸收波长的确定 精密移取适量2.2.1项芦丁对照品，加入60%乙醇溶液6 mL，5%亚硝酸钠溶液1 mL，混匀静置6 min后再加10%硝酸溶液1 mL，混匀静置6 min，最后加入4.3%氢氧化钠溶液10 mL，混匀静置15 min后测定，以相同的方法制备空白液，在400～700 nm[11-13]范围内扫描。结果对照品溶液和供试品溶液在500.8 nm处均有最大吸收，见图2。

图2 芦丁对照品和样品的紫外-可见光谱

2.2.4 标准曲线的制备 分别精密吸取2.2.1项下对照品储备液0.15、0.25、0.35、0.45、0.55 mL，在500.8 nm处测定上述方法显色后的不同浓度储备液的吸光度(A)值。以吸光度为纵坐标，以芦丁浓度为横坐标得到回归方程：Y=1.418X-0.009 7(r=0.999 4)。表明芦丁在0.3～1.1 mg范围内的线性关系良好。

2.2.5 精密度试验 精密吸取0.5 mL芦丁对照品溶液，在500.8 nm处连续测定6次上述方法显色后吸光度，得到RSD值为0.50，表明仪器精密度良好。

2.2.6 重复性试验 按拟定的实验方案平行制备6份供试品溶液，在500.8 nm处测定按2.2.1项显色后的吸光度，得到RSD值为0.75%，表明该方法重复性较好。

2.2.7 稳定性试验 精密移取0.5 mL按上述方法制备的供试品溶液，分别于制备后的第0、10、20、30、40、50、60 min测定按2.2.1项显色后的吸光度，得到RSD值为1.97%，结果表明供试品溶液在1 h内稳定。

2.2.8 加样回收率试验 取2.2.1项下已知浓度的供试品溶液，取样品与对照品含量为1∶1平行制备待测溶液6份，在2.2.1项下测定其吸光度，结果得到平均加样回收率为97.76%，RSD=0.37%，结果表明本品的加样回收率良好。

2.3 浸膏得率的测定

将50 mL供试液精密吸取于已干燥至恒重的蒸发皿中，蒸干后放入105 ℃烘箱内干燥3 h，在干燥器中冷却后迅速精密称定重量，计算其浸膏得率[14]。

(1)

2.4 单因素试验

分别对提取次数、提取时间、加醇浓度、加醇倍量进行单因素试验，根据单因素试验的结果来确定Box-Behnken响应面试验的因素水平范围[15-17]。

2.4.1 提取时间初步考察 按拟定处方量称取药材，将加醇倍量固定为10倍，加醇浓度固定为60%，提取次数固定为1次，考察提取时间分别为30、60、90、120 min时的综合评分，结果综合评分在30～60 min时呈递增趋势，60～90 min时呈递减趋势，故最佳提取时间确定60 min。

2.4.2 加醇浓度初步考察 按拟定处方量称取药材，将加醇倍量固定为10倍，提取时间固定为1 h，提取次数固定为1次，考察加醇浓度分别为50%、60%、70%、80%时的综合评分，结果综合评分在50%～60%呈递增趋势，60%～70%呈降低趋势，故最佳加醇浓度定为60%。

2.4.3 加醇倍量初步考察 按拟定处方量称取药材，将加醇浓度固定为60%，提取时间固定为1 h，提取次数固定为1次，考察加醇倍量分别为6倍、8倍、10倍、12倍时的综合评分，结果综合评分在8倍～10倍呈递增趋势，10倍～12倍呈下降趋势，故最佳加醇倍量定为10倍。

2.4.4 提取次数的初步考察 按拟定处方量称取药材，将加醇倍量固定为10倍，加醇浓度固定为60%，提取时间固定为1 h，分别考察提取1、2、3次的综合评分，最终综合评分分别为59.16%、94.10%、96.45%，由于提取2次和提取3次的综合评分结果差别不大，从工业化大生产节约成本的角度考虑，提取次数确定为2次。

2.5 Box-Behnken响应面法优化提取工艺

2.5.1 响应面试验设计 在单因素试验的基础上，按拟定处方量称取醇提药材，根据综合评价指标对醇提工艺的影响，确定综合评分=阿魏酸×0.4+总厚朴酚×0.2+总黄酮×0.2+浸膏得率×0.2(总厚朴酚=厚朴酚×0.5+和厚朴酚×0.5)，提取次数固定为1次，以提取时间(X1)、加醇浓度(X2)、加醇倍量(X3)作为考察指标进行Box-Behnken响应面设计[18-19]，因素及水平见表3。

表3 Box-Behnken实验设计的因素和水平

采用Design-Expert 软件设计试验方案，对加醇倍量、加醇浓度、提取时间进行研究[20-21]，结果见表4。

表4 Box-Behnken设计及结果

2.5.2 模型拟合 利用方差分析对各因素进行多元二次回归，得到的回归方程Y=90.46+11.92X1+2.81X2+3.77X3-3.55X1X2-2.99X2X3-1.71X1X3-13.41X12-7.29X22-8.04X32，由表5可知，X1、X2、X12、X22、X32具有显著影响，其影响程度为X2>X1>X3；失逆项P>0.05，说明失拟不显著，因此本回归方程能较好地分析与预测本研究的醇提工艺。根据回归分析结果绘制三维响应面图，见图3～4。

表5 回归模型的方差分析

图3 各因素对综合评分的三维响应面图

图4 提取工艺对各因素之间的等高线图

2.5.3 验证试验 通过对试验结果的分析，最佳醇提工艺：加入60.53%的乙醇10.36倍，提取72 min。结合实际生产所需，将最佳醇提工艺确定为60%的乙醇10倍量，提取60 min。按照最佳醇提工艺，进行3次平行验证试验，其综合评分分别为96.36、98.04、95.80，平均综合评分为96.73(RSD为1.21%)，与预测值(93.41)相似，说明次二项式方程的适用性良好。优选的提取工艺合理，可行。

3 讨论

参照2015年版《中华人民共和国药典》及文献方法测定阿魏酸及总厚朴酚含量时，考察了乙腈、甲醇、冰醋酸、磷酸等多种流动相体系，发现乙腈-冰醋酸体系对于阿魏酸及总厚朴酚体系峰型较好，保留时间适宜。考察冰醋酸时发现，1%冰醋酸使各色谱峰的分离度及峰型效果最好，为最优浓度，调整乙腈-1%冰醋酸溶液不同配比，最后选择流动相(0～17 min，12%乙腈；17～18 min，12%～54%乙腈；18～35 min，54%乙腈)。

采用紫外分光光度法测定总黄酮时，在1 h内显色结果稳定，超过1 h，供试品溶液则出现络合物沉淀，所以应在1 h内完成显色测定。

在研究初始阶段，首先采用文献研究法查阅相关文献，最终确定了处方中各味药材有效成分的理化性质及药理作用，确定其中部分药材使用醇提工艺，故采用多指标综合评分结合Box-Behnken响应面设计的方法，以阿魏酸、厚朴酚、和厚朴酚、总黄酮的含量及浸膏得率作为综合评价指标，通过一系列的实验研究获取了更加优化的心痛宁胶囊醇提工艺。此结果为工业化大生产奠定了研究基础，为以后的科研创新提供了思路。