加味左金方的提取工艺

李平，张华*，王亚，王燕

(1.山东中医药大学 药学院，山东 济南 250355；2.烟台山医院，山东 烟台 264001)

左金丸原方由黄连、吴茱萸按6∶1组成，有降逆止呕的作用，专门治疗肝火旺盛，横逆犯胃的病证，是临床治疗肝火犯胃证的经典方剂[5]。

方中大量使用性味苦寒、入心经的黄连来清心火、泻怒火，怒火得到清除则肝胃调和。但气郁化火之证，只使用黄连既担心郁结化不开，又可能会折伤阳气，所以又在其中加入吴茱萸，因为吴茱萸具有辛热的性味，它下气的作用可以帮助黄连调和胃气止呕，辛热的作用可以来制约黄连的苦寒性味，使此方还可疏肝解郁，肝气顺畅，郁结能够化开[6]。

黄连性味苦寒，吴茱萸性味辛热，它们之间的配伍属于寒热配对，治标的同时又兼顾治本，使其邪气被去除的同时，还不伤及体内的正气，药物组方虽然简单，但治病效果显著，为辛开苦降的代表方剂[7-8]。

延胡索味苦、微辛，温，拥有通畅血脉、舒畅气机又止痛的作用。在原左金丸的基础上配伍温中散寒、舒肝理气之品，可以提高舒肝止痛之效，扩大了左金丸的临床应用范围[9]。

1 仪器与试药

1.1 仪器

RE-301旋转蒸发器(上海予华设备仪器有限公司)；ZTS-1P真空干燥箱(台顺测试科技有限公司)；FA2004万分之一天平(上海良平仪器仪表有限公司)；LC-600B高效液相色谱仪(南京科捷分析仪器有限公司)；GR-202十万分之一型天平(广州市艾安得仪器有限公司)；VS-100UE超声波提取机(无锡沃信仪器有限公司)；HH.S11-Ni2电热恒温水浴锅(北京三二八科学仪器有限公司)。

1.2 试药

黄连、吴茱萸、延胡索购自山东宏济堂医药有限公司，经山东中医药大学中药教研室李峰教授鉴定均为正品。

盐酸小檗碱对照品、吴茱萸碱对照品、吴茱萸次碱对照品、延胡索乙素对照品(中国食品药品检定研究院，批号依次为110713-201212、110802-200908、110801-201207、110726-201213)；甲醇、浓盐酸、浓氨水、乙醇等为分析纯；乙腈、四氢呋喃、磷酸等为色谱纯。

2 不同提取工艺优化

2.1 不同提取工艺路线比较

2.1.1 相关成分含量测定方法 本实验为了比较不同工艺有效成分转移率，首先对黄连、延胡索、和吴茱萸3味有效成分明确的药根据《中华人民共和国药典》方法来检测。需要测定的成分为黄连里的小檗碱、吴茱萸里的吴茱萸次碱与吴茱萸碱、延胡索里的延胡索乙素[10]。

2.1.2 含量测定结果 按《中华人民共和国药典》测定方法，对各药材的有效成分含量分别测定，结果见表1。

表1 实验所用药材中各成分含量测定结果 %

2.1.3 不同提取工艺路线筛选

2.1.3.1 水提工艺 取药材2倍处方量，煎煮3次，使用8倍量的水，每次1.5 h，纱布(8层)过滤，合并滤液，离心，减压浓缩与干燥，得干膏，分别测定小檗碱、延胡索乙素、吴茱萸碱和吴茱萸次碱的转移率及得膏率，测定结果见表2。

表2水提工艺得膏率及相关成分转移率测定结果

%

结果分析：由表可知，水提取得膏率较高。从指标性成分转移率看，黄连有效成分极性较大，提取率较高，吴茱萸、延胡索有效成分脂溶性较强，提取率较低。通过测定的数据分析证明，醇提的方法可以有效提高药材中有效成分的转移率和得膏率[14]。

2.1.3.2 乙醇提取工艺考察(单因素考察) 乙醇浓度考察：分别取处方量2倍的药材，共5份，分别加50%、60%、70%、80%、90%的8倍量乙醇，做3次加热回流提取，每次1.5 h，过滤时使用8层纱布，将滤液合并，离心，减压浓缩与干燥，HPLC测定样品中小檗碱、延胡索乙素、吴茱萸碱和吴茱萸次碱的含量，计算转移率，结果见图1[15]。

转移率(%)=提取完浸膏含量×浸膏量/
含量测定药材用量×药材含量

(1)

图1 乙醇浓度考察

结果表明，小檗碱的提取率跟着乙醇浓度的增大，先增长后消减；而高浓度乙醇有利于延胡索乙素、吴茱萸碱和吴茱萸次碱的提出，可能是由于它们的脂溶性较强。由图1可知，80%乙醇与90%乙醇对于有效成分的转移率差别不大，出于经济考虑，不易选用90%的乙醇。故处方提取溶剂选取80%乙醇[16]。

溶剂用量考察：分别取2倍处方量的药材，共4份，添加6、8、10、12倍量80%的乙醇，做3次回流提取，每次1.5 h，过滤，使用8层纱布，合并滤液，离心，减压浓缩与干燥，得干膏，HPLC测定样品中小檗碱、延胡索乙素、吴茱萸碱和吴茱萸次碱的含量，计算转移率，结果见图2[17]。

图2 溶剂用量考察

结果表明，溶剂8、10、12倍量对3种生物碱的提取率影响差异很小，6倍量的溶剂对3种生物碱的提取率虽较低，但与其他3种水平相比，相差也不太大，出于经济考虑，故选择6、8、10倍量这3个水平来进一步考察最佳溶剂用量。

提取时间考察：分别取处方量2倍的药材，共4份，各加入8倍量80%的乙醇，进行3次加热回流提取，每次回流时间分别是1.0、1.5、2.0、2.5 h，过滤，8层纱布，将滤液合并，离心，减压浓缩与干燥，得干膏，HPLC测定样品中小檗碱、延胡索乙素、吴茱萸碱和吴茱萸次碱的含量，计算转移率，结果见图3。

图3 提取时间考察

结果表明，3种生物碱的提取率随提取时间的延伸，先增长后基本保持稳定，故选择1.0、1.5、2.0 h这3个水平来进一步考察最佳提取时间[18]。

提取次数考察：分别取处方量2倍的药材，共4份，各加入80%的8倍量乙醇，分别加热回流提取1、2、3、4次，每次1.5 h，8层纱布过滤，合并滤液，离心，减压浓缩与干燥，得干膏，HPLC测定样品中小檗碱、延胡索乙素、吴茱萸碱和吴茱萸次碱的含量，计算转移率，结果见图4[19]。

图4 提取次数考察

结果表明，提取1次与提取2次3种生物碱的提取率存在很大不同，提取3次与提取4次结果相近，故选择1、2、3次这3个水平来进一步考察最佳提取次数。

醇提工艺参数的正交优选：根据单因素的考察结果，取处方量2倍的药材，以提取时间、溶剂用量和提取次数为三要素，每因素拟定三水平进行正交试验，测定小檗碱(a)、延胡索乙素(b)、吴茱萸碱和吴茱萸次碱(c)提取率，计算出得膏率(d)，优选醇提最佳工艺[20]。

综合评分为Z，则Z=(ai/amax)×0.5+(bi/bmax)×0.2+(ci/cmax)×0.2+(di/dmax)×0.1(i=1～9)。结果见表4，方差分析结果见表5。

表3 复方醇提工艺因素水平

以上因素对转移率和浸膏得率的影响依次为：C>A>B，所以C为主要因素，C3>C2>C1；A、B为次要因素，A2>A3>A1，B3>B2>B1，直观分析最优工艺应为：A2B3C3。

方差分析：因素C是显著因素，各水平之间存在明显区别，故选择最优水平C3；因素B不是显著因素，各水平之间无明显差异，从实际操作和物力财力耗费考虑，故选择B2；即初步确定工艺为A2B2C3，所以最终得出了该实验的最佳方案：加80%的8倍量乙醇，加热回流提取3次，每次1.5 h。

表4 醇提正交试验结果与分析

表5 正交试验结果方差分析

注：“*”为有显著性(P<0.05)。

提取工艺验证试验：对以上实验得到的最优工艺A2B2C3与直观分析得到的最佳工艺A2B3C3进行进一步的工艺验证，以比较两种方案的提取效果是否有显著差异。按处方比例，取2倍处方量药材2份进行验证，测定各药物的有效成分提取率，计算出得膏率，结果见表6。

表6 提取工艺比较验证结果(n=3) %

结果表明，提取率及得膏率差异不是很大，初步拟定工艺可作为本处方的提取工艺。

为考察上述工艺的稳定性，取2倍处方量的药材3份，分别按上述拟定工艺提取，测定相关成分提取率，计算得膏率，结果见表7。

结果表明，该工艺稳定可行，故认为加味左金方的提取工艺为吴茱萸、黄连、延胡索加8倍量，80 %乙醇加热回流提取3次，每次1.5 h。以优选出的最佳工艺进行提取，用高效液相进行各成分的含量测定，结果见图5～7。

表7 提取工艺验证结果(n=3) %

注：A.盐酸小檗碱对照品；B.供试品；C.阴性对照。图5 小檗碱含量测定HPLC图

注：A.吴茱萸碱对照品；B.吴茱萸次碱对照品；C.供试品；D.阴性对照。图6 吴茱萸含量测定HPLC图

注：A.延胡索乙素对照品；B.供试品；C.阴性对照。图7 延胡索乙素含量测定HPLC图