TNF—α椎间盘注射对软骨终板β—catenin与Adamts—5表达影响

魏平洋　　夏炳江　　沈钦荣　　胡松峰　　侯明生

[摘要] 目的 探討TNF-α椎间盘注射对大鼠软骨终板β-catenin与Adamts-5蛋白表达的影响与意义。 方法 取SPF级12周龄SD大鼠30只，随机分成空白对照组（A组）、假手术组（B组）、TNF-α椎间盘注射组（C组），每组10只（n=10）。C组大鼠在X线透视下穿刺椎间盘并注射TNF-α 25 μL（10 ng/μL），B组大鼠椎间盘穿刺成功后注射生理盐水25 μL，A组大鼠椎间盘不做任何干预。术后4周采用组织病理学观察软骨终板退变情况，并采用Western-Blot检测软骨终板β-catenin与Adamts-5蛋白表达。 结果 HE染色显示C组大鼠椎间盘软骨终板出现明显退行性改变。Western-Blot检测显示C组大鼠椎间盘软骨终板β-catenin与Adamts-5表达均显著上调，与A组及B组相比，差异有统计学意义（P<0.05）。 结论 TNF-α椎间盘注射可诱发椎间盘软骨终板退变，同时上调软骨终板β-catenin及Adamts-5表达，提示TNF-α上调β-catenin及Adamts-5表达在软骨终板退变中可能发挥了重要作用。

[关键词] TNF-α；软骨终板；β-catenin；Adamts-5

[中图分类号] R681.5 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2018）17-0024-04

Effect of intervertebral disc injection of TNF-α on the expression of β-catenin and Adamts-5 in cartilage endplate

WEI Pingyang1 XIA Bingjiang1，2 SHEN Qinrong1 HU Songfeng1 HOU Mingsheng1

1.Department of Orthopedics， Shaoxing Hospital of TCM， Shaoxing 312000， China； 2.Zhejiang Chinese Medical University， Hangzhou 310053， China

[Abstract] Objective To investigate the effect and significance of intervertebral disc injection of TNF-α on the expression of β-catenin and Adamts-5 protein in rat cartilage endplate. Methods 30 Sprague-Dawley（SD） rats of SPF grade were randomly divided into blank control group（group A）， sham operation group（group B） and TNF-α intervertebral disc injection group（group C）， with 10 rats in each group. The rats in group C were given intervertebral disc puncture under X-ray and injected with TNF-α of 25 μL（10 ng/μL）. Rats in group B were injected with normal saline of 25 μL after successful intervertebral disc puncture. Rats in group A were not given any intervention on intervertebral disc. Four weeks after operation， histopathology was used to observe the degeneration of cartilage endplate. The expression of β-catenin and Adamts-5 proteins in cartilage endplate was detected by Western-Blot. Results HE staining showed obvious degenerative changes of intervertebral cartilage endplate in the rats in group C. The results of Western-Blot showed that the expressions of β-catenin and Adamts-5 in the cartilage endplate in group C were significantly increased compared with those in group A and B， and the differences were statistically significant（P<0.05）. Conclusion Intervertebral disc injection of TNF-α can induce degeneration of intervertebral disc cartilage endplate， and at the same time， the expression of β-catenin and Adamts-5 in cartilage endplate is up-regulated， indicating that up-regulation of β-catenin and Adamts-5 expression by TNF-α may play an important role in the degeneration of cartilage endplate.

[Key words] TNF-α； Cartilage endplate； β-catenin； Adamts-5

作为椎间盘营养供应的主要途径，软骨终板对椎间盘的营养供应和形态维持均具有重要作用[1]。Wnt/β-catenin信号通路在软骨退变、抑制软骨分化与修复、抑制软骨细胞外基质合成中均发挥重要作用[2]。研究表明Wnt/β-catenin信号通路可通过上调Ⅰ型血小板结合蛋白基序的解聚蛋白样金属蛋白酶（a disintesrin and metalloprotease with thrombospondin type Ⅰ motifs，Adamts）-5而诱发椎间盘退变[3]。Adamts-5是软骨基质蛋白聚糖（Aggrecan）的主要降解酶，蛋白聚糖对软骨抗压力和张力等物理属性起着重要的作用。TNF-α作为一种炎症因子，在椎间盘退变中的作用越来越受到重视。本研究拟观察TNF-α椎间盘注射对大鼠椎间盘软骨终板Wnt/β-catenin信号通路关键基因β-catenin及下游基因Adamts-5表达的影响。

1 材料與方法

1.1 实验动物及分组

健康雄性SPF级SD大鼠30只，12周龄，体重200～250 g，由浙江中医药实验动物中心提供（实验动物号：SYXK-浙-2008-0115）。分笼饲养，安静环境，室温22℃。采用随机区组设计法将大鼠分成空白对照组（A组）、假手术组（B组）、TNF-α椎间盘注射组（C组），每组10只大鼠（n=10）。

1.2 干预措施

C组大鼠在腹腔注射10%水合氯醛（3 mL/100 g）麻醉后，在X线透视下利用0.06 mm穿刺针刺入尾椎5/6椎间盘（Co5/6），利用微量注射器向椎间盘内注射TNF-α 25 μL（10 ng/μL），B组大鼠在麻醉后行Co5/6椎间盘穿刺注射生理盐水25 μL，A组大鼠只进行腹腔注射麻醉，不对椎间盘进行任何干预处理。术后正常饲养，自由饮水、进食。大鼠术后常规青霉素肌肉注射20万单位，每日1次，持续3 d。

1.3 检测指标

术后4周，切取大鼠Co5/6椎间盘软骨终板，采用组织病理学观察椎间盘软骨终板退变情况，采用Western-Blot检测β-catenin与Adamts-5蛋白表达。

1.3.1 组织病理学 将取下的Co5/6椎间盘上下软骨终板，利用4%多聚甲醛固定48 h后，EDTA脱钙液脱钙4周，常规脱水、石蜡包埋、连续切片，HE染色。光镜下观察椎间盘软骨终板组织形态学改变。

1.3.2 Western-Blot 利用液氮快速将取下的Co5/6椎间盘软骨终板研磨后加入RIPA蛋白裂解液提取蛋白，利用BCA方法进行蛋白浓度鉴定。加入5×loading buffer，100℃，5 min变性。每孔按50 μg上样，经10% SDS-PAGE凝胶电泳分离后，将蛋白转至PVDF膜上，室温下5%脱脂奶粉封闭1 h，加入一抗β-actin（1：1000）、β-catenin（1：500）及Adamts-5（1：1000），4℃冰箱孵育过夜，PBS洗膜3次，10 min/次，加入对应的辣根过氧化物酶标记的二抗（1：3000），室温孵育1 h，PBS洗膜3次，10 min/次，采用ECL化学发光法显色，计算目的蛋白条带灰度值，并与内参蛋白β-actin条带灰度值比较，计算比值。见封三图2。

1.4观察指标

对软骨终板退变情况给予组织病理学观察，并采用Western-Blot检测软骨终板β-catenin与Adamts-5蛋白表达。

1.5 统计学方法

采用SPSS 18.0软件进行统计学分析。计量资料以均数±标准差（x±s）表示，采用单因素方差分析。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HE染色结果

A组大鼠椎间盘软骨终板软骨细胞排列规则，血管芽丰富。C组大鼠椎间盘软骨终板变薄，钙化，软骨细胞数量减少，排列紊乱，软骨终板和髓核之间的过渡区出现小软骨细胞，血管芽数目减少。B组大鼠椎间盘软骨终板亦出现退变表现，但程度较C组大鼠明显减轻。见封三图3。

2.2 三组β-catenin与Adamts-5蛋白表达

Western-Blot结果显示C组大鼠椎间盘软骨终板中β-catenin与Adamts-5蛋白含量明显增加，与A组及B组相比，差异有统计学意义（P<0.05）。与A组大鼠相比，B组大鼠椎间盘软骨终板β-catenin与Adamts-5蛋白量亦出现增高（P<0.05），但较C组大鼠低（P<0.05）。

3讨论

椎间盘退变（intervertebral disc degeneration，IDD）及其相关的脊柱疾病有很高的发病率，据统计[4]，约80%的人在其一生中会因IDD相关疾病而就诊。据报道，在美国等西方国家腰腿痛所致的年经济负担保守估计已达196亿美元[5]。随着中国人口老龄化，这一问题也逐渐突出，相应的医疗费用呈逐年上升趋势，给患者和社会造成沉重的经济负担，一直是骨伤科医师所面临的最困难的挑战之一。椎间盘软骨终板（cartilage endplate，CEP）作为椎间盘的主要营养途径，对椎间盘的营养供应以及力学性能维持都具有十分重要的作用，CEP退变是IDD的始动因素。

目前，TNF-α作为一种具有多种生物学效应的细胞因子，在CEP退变发生中的作用越来越受到重视。大量文献证实，退变CEP中TNF-α的表达明显增高。如刘斌等[6]研究发现随着CEP退变加剧，其TNF-α含量亦随之增加，提示TNF-α表达与CEP退变呈正相关。叶伟等[7]通过体外细胞实验发现一定浓度的TNF-α可抑制CEP细胞增殖与细胞外基质的合成，促进CEP细胞促凋亡因子的生成，从而加速CEP退变的发生。Chen等[8]发现TNF-α可通过激活核因子κ-B途径来促进CEP细胞凋亡与细胞外基质降解。此外，有临床研究表明TNF-α在腰腿痛症状发生中起重要作用，特别是在腰椎终板出现Modic改变的腰椎间盘突出症患者[9]。由此可见，TNF-α表达异常增高是CEP退变的重要病理生理学特征。本研究采用外源性TNF-α椎间盘注射成功诱导大鼠椎间盘软骨终板出现退变，直观的验证了TNF-α在CEP退变中作用。

但目前認为，TNF-α介导各种蛋白酶表达升高，引起细胞外基质降解，在CEP退变中起着关键性作用。如Seguin等[10]研究发现，TNF-α可通过上调基质降解酶表达而促进椎间盘细胞外基质丢失、蛋白聚糖降解，进而诱发椎间盘退变。Adamts-5是目前公认的最重要的聚蛋白聚糖酶，在降解软骨聚蛋白聚糖的过程中起重要作用[11-16]。本研究发现在TNF-α诱导的椎间盘退变CEP中Adamts-5表达上调，提示TNF-α可上调Adamts-5的表达，促使CEP细胞外基质降解，可能在CEP退变发生发展中发挥关键作用。

此外，本研究亦同时发现在TNF-α诱导的椎间盘退变CEP中β-catenin蛋白表达增高。目前，已有大量研究表明Wnt/β-catenin信号通路对椎间盘退变的发生发展具有重要调控作用。如Gao SG等[17]对β-catenin基因条件性过表达小鼠（cAct）研究发现小鼠椎体有大量骨赘形成，椎间盘细胞与细胞外基质出现明显退变表现。学者Chen J、Saito T[18-19]发现激活β-catenin信号，能上调椎间盘组织Adamts-5的表达，而蛋白聚糖和Ⅱ型胶原合成下降。Mori Y等[20]认为Wnt/β-catenin通路对椎间盘细胞外基质合成的负调控作用可能部分是通过激活下游靶基因Adamts-5表达所介导的。结合本实验研究结果，认为TNF-α可能介导Wnt/β-catenin信号通路上调Adamts-5的表达，后者通过降解细胞外基质，从而参与椎间盘CEP退变的病理过程，但具体机制有待于进一步验证。

[参考文献]

[1] Hee HT，Chuah YJ，Tan BH，et al. Vascularization and morphological changes of the endplate after axial compression and distraction of the intervertebral disc[J]. Spine（Phila Pa 1976），2011，36（7）：505-511.

[2] Lories RJ，Peeters J，Bakker A，et al. Articular cartilage and biomechanical properties of the long bones in Frzb-knockout mice[J]. Arthritis Rheum，2007，56（12）：4095-4103.

[3] Wang M，Tang D，Shu B，et al. Conditional activation of β-catenin signaling in mice leads to severe defects in intervertebral disc tissue[J]. Arthritis Rheum，2012，64（8）：2611-2623.

[4] Deyo RA，Weinstein JN. Low back pain[J]. N Engl J Med，2001，344（5）：363-370.

[5] Richardson SM，Doyle P，Minogue BM，et al. Increased expression of matrix metalloproteinase-10，nerve growth factor and substance P in the painful degenerate intervertebral disc[J]. Arthritis Res Ther，2009，11（4）：R126.

[6] 刘斌，金大地，瞿东滨，等. IL-1β、IL-6、TNF-α在兔腰椎软骨终板退变中的变化及作用[J]. 中国矫形外科杂志，2007，15（1）：64-66.

[7] 叶伟，黄东生，梁安靖，等. TNF-α对兔软骨终板细胞增殖、凋亡及基质形成的影响[J]. 中国病理生理杂志，2008，24（9）：1830-1834.

[8] Chen S，Huang Y，Zhou ZJ，et al. Up-regulation of tumor necrosis factor-α and ADAMTS-5 but not ADAMTS-4 in human intervertebral cartilage endplate with modic changes[J]. Spine（Phila Pa 1976）， 2014， 39（14）：E817-825.

[9] You C，Zhu K，Liu X，et al. Tumor necrosis factor-alpha-dependent infiltration of macrophages into the dorsal root ganglion in a rat disc herniation model[J]. Spine （Phila Pa1976）， 2013， 38（23）：2003-2007.

[10] Seguin CA，Bojarski M，Pilliar RM，et al. Differential regulation of matrix degrading enzymes in a TNF alpha-induced model of nucleus pulposus tissue degeneration[J].Matrix Biol，2006，25（7）：409-418.

[11] Stanton H，Rogerson FM，East CJ，et al. ADAMTS5 is the major aggrecanase in mouse cartilage in vivo and in vitro[J].Nature，2005，434（7033）：648-652.

[12] 馬骁，杨学军，霍洪军，等. 髓核内注射转化生长因子-β_1对兔软骨终板Ⅱ型胶原表达影响的实验研究[J]. 创伤外科杂志，2011，13（4）：344-348.

[13] 余作冲，熊敏，吴靖平，等. 转化生长因子β3对椎间盘退变大鼠软骨终板的作用研究[J]. 中国临床医学，2014， 21（2）：141-143.

[14] Li W，Wu M，Jiang S，et al. Expression of ADAMTs-5 and TIMP-3 in the condylar cartilage of rats induced by experimentally created osteoarthritis[J]. Archives of Oral Biology，2014，59（5）：524-529.

[15] 陈军平，王兆杰，安荣泽，等. 软骨终板通透性对兔退变腰椎间盘Ⅱ型胶原表达的影响[J]. 临床和实验医学杂志，2014，21（10）：781-784.

[16] 郑为超，牛凯，赵永见，等. 苦杏仁苷对IL-1β诱导后大鼠椎间盘软骨终板细胞凋亡的影响[J]. 中国药理学通报，2014，30（12）：1734-1739.

[17] Gao S G，Zeng C，Song Y，et al. Effect of osteopontin on the mRNA expression of ADAMTS4 and ADAMTS5 in chondrocytes from patients with knee osteoarthritis[J]. Experimental & Therapeutic Medicine，2015，9（5）：1979.

[18] Chen J，Ling M，Fu X，et al. Simultaneous exposure of sites in von Willebrand factor for glycoprotein Ib binding and ADAMTS13 cleavage：Studies with ristocetin[J]. Arteriosclerosis Thrombosis & Vascular Biology，2012，32（11）：2625.

[19] Saito T，Nishida K，Furumatsu T，et al. Histone deacetylase inhibitors suppress mechanical stress-induced expression of RUNX-2 and ADAMTS-5 through the inhibition of the MAPK signaling pathway in cultured human chondrocytes[J]. Osteoarthritis & Cartilage，2013，21（1）：165-174.

[20] Mori Y，Saito T，Chang SH，et al. Identification of fibroblast growth factor-18 as a molecule to protect adult articular cartilage by gene expression profiling[J]. Journal of Biological Chemistry，2014，289（14）：10192-10200.

（收稿日期：2018-01-26）