PAQR3基因在胃癌组织中的甲基化状态及其临床意义

陶利萍　　金尹　　胡畅远　　陈旭艳

[摘要] 目的 探讨孕酮和脂联素受体3（Progestin And Adipo Q Receptor Ⅲ，PAQR3）基因在胃癌组织中的甲基化状态及其临床意义。 方法 收集2015年3～9月经病理确诊的原发性胃癌及癌旁组织45对，采用甲基化特异性PCR法检测PAQR3基因启动子区甲基化水平，免疫组化法检测PAQR3蛋白的表达，并分析其与患者肿瘤临床病理特征之间的关系。 结果 胃癌组织中PAQR3基因启动子甲基化率（44.44%，20/45）显著高于癌旁组织（8.89%，4/45，P<0.001），而PAQR3蛋白表达则较癌旁组织显著降低，两者间呈负相关（r=-0.478，P<0.01）。PAQR3基因启动子甲基化率及PAQR3蛋白的表达与肿瘤浸润深度、淋巴结转移、TNM分期相关（P<0.01）。 结论 PAQR3基因启动子区高甲基化可能是引起胃癌组织PAQR3表达降低的重要原因，有望成为胃癌病情和预后评估的分子标记物以及表观遗传学治疗靶点。

[关键词] PAQR3；甲基化；胃癌；表达

[中图分类号] R735.2 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2018）17-0009-04

Methylation status of PAQR3 gene in gastric cancer and its clinical significance

TAO Liping1 JIN Yin1 HU Changyuan2 CHEN Xuyan1

1.Department of Gastroenterology，the First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University，Wenzhou 325000，China；2.Department of Gastrointestinal Surgery，the First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University，Wenzhou 325000，China

[Abstract] Objective To investigate the methylation status of Progestin And AdipoQ Receptor III （PAQR3）gene in gastric cancer and its clinical significance. Methods Forty-five pairs of primary gastric cancer and paracancerous tissues confirmed by pathology from March to September 2015 were collected. Methylation-specific PCR was used to detect the methylation level of PAQR3 gene promoter. Immunohistochemistry was used to detect protein of PAQR3 expression and analyzed its relationship with the clinicopathological features of patients' tumors. Results The methylation rate of PAQR3 gene promoter was significantly higher in gastric cancer tissues（44.44%， 20/45） than that in paracancerous tissues（8.89%， 4/45， P<0.001）， while the expression of PAQR3 protein was significantly lower than that in adjacent tissues. There was a negative correlation between the methylation rate of PAQR3 and the expression of PAQR3 protein（r=-0.478， P<0.01）. The methylation rate of PAQR3 promoter and the expression of PAQR3 protein were correlated with tumor invasion depth， lymph node metastasis and TNM stage（P<0.01）. Conclusion The hypermethylation of PAQR3 gene promoter region may be an important cause of the decrease of PAQR3 expression in gastric cancer tissues and may be a molecular marker and epigenetic target for the evaluation of the prognosis of gastric cancer.

[Key words] PAQR3；Methylation；Gastric cancer；Expression

胃癌是臨床最常见的恶性肿瘤之一，严重威胁我国人民的生存寿命及生活质量，据国家癌症中心统计数据显示，2014年我国胃癌发病率在男性及女性中分别占第二和第四位，而死亡率更是均高居第二位[1]，因此研究胃癌相关基因的作用机制及其临床意义对胃癌的防治具有重要的临床价值。胃癌的发病与基因的异常表达密切相关，其机制包括基因突变及表观遗传学调控，而DNA的甲基化改变是表观遗传学调控的重要内容，其中抑癌基因启动子的高甲基化被认为是恶性肿瘤发生的重要原因[2，3]。孕酮和脂联素受体3（progestin and adipo Q receptor Ⅲ， PAQR3）是一类新命名的跨膜蛋白家族的成员，在能量代谢、细胞凋亡及肿瘤发生等方面发挥着重要的调控作用[4，5]。近年来的研究发现PAQR3蛋白的表达在胃癌组织中显著下降，是影响胃癌的恶性度、转移及预后等的一个新的关键蛋白[6]。但目前尚无PAQR3基因启动子甲基化状态与胃癌的相关研究报道，因此本研究拟了解PAQR3基因在胃癌组织中的甲基化状态及其临床意义，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

收集2015年3～9月在我院经手术治疗并经病理确诊的胃癌患者45例，其中男26例，女19例，年龄33～75岁，平均（56.2±8.1）岁。所有患者术前均未接受放疗、化疗及生物靶向等治疗，同时排除合并其他肿瘤或胃息肉。每例患者均取癌组织及对应癌旁正常组织，手术切除半小时内完成标本收集，一份标本临时保存于液氮内，再转移至-80℃冰箱内保存；另一份标本由福尔马林固定后按常规制作蜡块保存。同时收集患者的临床及病理资料，确定TNM分期、组织学分化、肿瘤浸润深度及淋巴结转移等情况。

1.2 研究方法

1.2.1 免疫組化 将患者癌组织及癌旁组织蜡块进行切片，常规免疫组化染色，一抗浓度为1∶50（美国Santa Cruz），待切片显色后适时终止反应，以细胞胞浆内出现阳性PAQR3颗粒为阳性，具体以半定量法判断：①阳性细胞率（记为a）：取每张切片5个随机高倍视野下计数100个此类细胞，以阳性细胞的平均数记为百分比：≤5%计0分，6%～25%计1分，26%～50%计2分，51%～75%计3分，>76%计4分；②染色强度（记为b），以多数细胞的染色强弱计分：无明显着色0分，黄色1分，棕黄色2分，棕褐色3分；③a×b乘积为总评分，0分为（-），1～4分为（+），5～8分为（++），9～12分为（+++）。由于正常组织中PAQR3蛋白表达阳性率及强度均较高，PAQR3蛋白表达下降率定义为蛋白表达（-）与（+）之和占总例数的百分比。

1.2.2 甲基化特异性PCR 将-80℃冰箱保存的组织标本研磨后，蛋白酶K消化，采用酚/氯仿抽提法提取基因组DNA，分光光度计检测浓度与纯度，亚硫酸盐修饰并脱盐纯化回收，最后MSP法检测PAQR3基因启动子甲基化状态。参考文献[7]设计甲基化和非甲基化引物，分别用于扩增PAQR3基因CpG岛甲基化和非甲基化的等位基因。PAQR3甲基化引物（PAQR3-M）：上游为5-TTGTTGAAGAGCGCGTATTATATC-3，下游为5- TAAAAACCCGAAAATCTACTCGTA -3，扩增片段约109bp大小。PAQR3非甲基化引物（PAQR3-U）：上游为：5-TTGTTGAAGAGTGTGTATTATATTGA-3，下游为5-TAAAAAACCCAAAAATCTACTCATA -3，扩增片段约110bp大小。PCR反应条件为95℃，5 min；95℃，10 s，60℃，32 s，40个循环；95℃，15 s，60℃，60 s，95℃，15 s。扩增产物于2%琼脂糖凝胶电泳，紫外分析仪分析。

1.3 统计学方法

采用SPSS 22.0统计软件，计数资料以[n（%）]表示，采用χ2检验，相关性采用Spearman相关性分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 胃癌组织及癌旁组织中PAQR3蛋白表达及PAQR3基因启动子的甲基化状态

免疫组化结果显示PAQR3蛋白主要定位于细胞胞浆内。在45例胃癌组织中，19例PAQR3蛋白表达（-），5例表达（+），15例表达（++），6例表达（+++），而在45例正常胃上皮组织中，4例PAQR3蛋白表达（-），3例表达（+），15例表达（++），23例表达（+++）。胃癌组织中PAQR3蛋白表达下降率为53.33%，而相应癌旁组织中表达下降者仅占15.56%，两组间存在显著差异（P<0.001）。见表1。

MSP结果显示胃癌组织中PAQR3基因启动子区CpG岛甲基化率为44.44%，而癌旁组织中仅8.89%，两者之间存在显著差异（P<0.001），胃癌组织中PAQR3基因启动子区甲基化率较癌旁组织显著升高。

2.2 胃癌组织中PAQR3蛋白表达及PAQR3基因甲基化与临床病理特征的关系

胃癌组织中PAQR3蛋白的表达下降与肿瘤浸润深度、淋巴结转移、TNM分期相关（P<0.05），与患者性别、年龄、组织学分化无关，与肿瘤大小可能相关，但尚未达到统计学差异（P=0.113）。胃癌组织PAQR3蛋白的表达在肿瘤浸润性高（T3～T4）、有淋巴结转移、TNM分期高（Ⅲ～Ⅳ）的患者中较肿瘤浸润性低（T1～T2）、无淋巴结转移、TNM分期低（Ⅰ～Ⅱ）的患者中显著降低（P<0.05）（表2）。PAQR3蛋白表达量与患者肿瘤的浸润深度、淋巴结转移、TNM分期之间的Spearman相关系数分别为-0.373、-0.418、-0.443（P<0.05）。

胃癌组织中PAQR3基因甲基化率与肿瘤浸润深度、淋巴结转移、TNM分期显著相关（P<0.05），与患者性别、年龄、组织学分化无关，与肿瘤大小可能相关，但尚未达到统计学差异（P=0.066）。胃癌组织PAQR3基因甲基化率在肿瘤浸润性高（T3～T4）、有淋巴结转移、TNM分期高（Ⅲ～Ⅳ）的患者中较肿瘤浸润性低（T1～T2）、无淋巴结转移、TNM分期低（Ⅰ～Ⅱ）的患者中显著升高（P<0.05）（表2）。PAQR3基因甲基化率与肿瘤的浸润深度、淋巴结转移、TNM分期之间的Spearman相关系数分别为0.312、0.365、0.337（P<0.05）。

2.3 胃癌组织中PAQR3蛋白表达量与PAQR3基因甲基化之间的相关性

24例PAQR3蛋白降低的胃癌患者中，17例存在PAQR3基因甲基化，而21例PAQR3蛋白正常的患者中，仅有4例存在PAQR3基因甲基化。相关性分析发现，胃癌组织中PAQR3蛋白表达量与PAQR3基因的甲基化之间存在显著负相关，Spearman相关系数为-0.478（P<0.01）。见表3。

3 讨论

DNA甲基化是肿瘤发生、发展的重要机制之一，主要由广泛的低甲基化和局部高甲基化引起[8]。很多研究显示抑癌基因启动子区域的高甲基化可导致相应抑癌基因的表达减少，对肿瘤的抑制作用减弱从而导致肿瘤的发生[9-11]。甲基化检测是肿瘤早期诊断、预后判断和靶向治疗的理想工具。近年来，基于基因甲基化检测的精准医疗及液体活检等技术在肿瘤的早期诊断、预后判断及术后的随访监测等方面得到了越来越多的应用和肯定。因此，进一步认识和研究抑癌基因在胃癌中的甲基化状态及其临床意义有着重要的临床价值。

PAQR3是近年来发现的一个新的抑癌基因，又名高尔基体Raf激酶锚定蛋白，是PAQR家族（progesterone and adipo Q receptor family）的一员，该基因定位于人的4号染色体上（4q21.21），编码37 kDa左右的膜蛋白[12，13]。近年的研究显示PAQR3在多种肿瘤中表达降低，包括结直肠癌[14]、乳腺癌[7]、肝癌[15]、肺癌[16]等，并与肿瘤的组织分化、淋巴结转移、分期及预后等有着不同程度的相关性。PAQR3通过对Ras/Raf/MEK/ERK信号通路的调控，从而影响细胞的增殖、分化及凋亡，并参与细胞的恶性转化及癌症的发生发展过程[17]。2014年梁晓辉等[16]的报道显示胃癌组织中PAQR3基因的mRNA及蛋白的表达量较癌旁组织显著下调，且与幽门螺杆菌的感染程度、肿瘤大小、分期、脉管侵犯、远处转移及患者的存活率有关。PAQR3可以通过调节ERK和AKT介导的信号通路及调控Twist1的水平影响胃癌细胞的增殖、迁移及上皮-间质转化[6，18]，Qiao S等[19]的体外实验也证实PAQR3可抑制胃癌细胞的生长和迁移能力。这些研究显示PAQR3可能成为胃癌发病机制研究的一个突破点，但目前PAQR3基因表达沉默的机制并不清楚，尚无文献报道PAQR3基因启动子甲基化在胃癌中的表达情况。

本研究的结果显示：胃癌组织中PAQR3蛋白表达量较癌旁组织显著下调，且与肿瘤的浸润深度、淋巴结转移、TNM分期相关，而与患者性别无关，与Ling ZQ等[6]的研究结果相同。相较而言，本研究未显示PAQR3蛋白表达量与患者年龄、肿瘤组织学分化的相关性，可能与纳入的病例数、研究人群及地域等不同有关。本研究结果进一步显示胃癌组织中PAQR3基因启动子区甲基化率较癌旁组织显著升高，且与PAQR3蛋白的表达量呈负相关，提示PAQR3基因启动子区高甲基化可能是引起胃癌组织中PAQR3蛋白表达量减少或沉默的重要原因。同时，本研究结果还显示胃癌组织中PAQR3基因启动子区甲基化率与肿瘤的浸润深度、分期、淋巴侵犯相关，提示PAQR3基因启动子区高甲基化与胃癌的发生及进展密切相关，有可能成为判断胃癌病情及预后的分子指标。目前仅有的数篇PAQR3基因甲基化的文献显示PAQR3基因启动子区在前列腺癌组织、结直肠癌组织及乳腺癌组织中较相应的对照组存在高甲基化，且分别与前列腺癌的神经束侵犯、结直肠癌的分化程度、浸润深度、淋巴结转移及乳腺癌的淋巴结转移相关[7，14，20]，与本研究的结果类似，提示PAQR3基因启动子区高甲基化可作为肿瘤病情判断及预后随访的候选指标。Chen J等[7]的研究还显示在乳腺癌细胞系中过表达PAQR3可抑制细胞的侵袭和生长，而去甲基化药物处理可恢复乳腺癌細胞中PAQR3蛋白的表达并抑制其细胞增殖与侵袭，从而进一步说明PAQR3基因启动子区高甲基化可能是PAQR3蛋白表达减少或沉默的重要原因，同时指出PAQR3基因去甲基化治疗的潜在意义。当然，抑癌基因的表达沉默常涉及多种机制，本研究中24例PAQR3蛋白降低的胃癌患者中有7例无PAQR3基因甲基化，也提示PAQR3基因甲基化并非PAQR3蛋白表达降低的唯一原因，还有其他的基因沉默机制在发挥作用，如泛素化降解[19]等也可能参与PAQR3蛋白的调控，仍需要进一步深入地研究。

总之，本研究显示胃癌组织中PAQR3基因启动子区存在高甲基化，与PAQR3蛋白表达呈负相关，并与胃癌的浸润深度、TNM分期及淋巴转移相关，胃癌组织中PAQR3基因启动子甲基化状态是胃癌病情评估潜在的分子指标及可能的治疗靶点。

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（收稿日期：2018-01-21）