1株产生洛伐他汀杂色曲霉的筛选、鉴定和发酵优化条件

许楚旋 王嘉琦 蒋冬花

（浙江师范大学化学与生命科学学院，金华 321004）

曲霉（Aspergillus spergillus）是最常见且具有重要应用价值的丝状真菌，在自然界的空气、土壤、水以及作物上都可以发现其存在，目前已广泛地应用在传统酿造业、生物工程研究和现代发酵等。杂色曲霉（A. versicolor）是世界性广泛分布种，也是我国最常见的曲霉之一。杂色曲霉（A. versicolor）作为曲霉属的一种，能产生多种有用的活性代谢产物，分别具有抗病［1］、抗虫［1］、抗病毒［2］、抗肿瘤［3］、抗氧化［4］、细胞免疫［5］和抗炎症［6］等多种生物活性。罗寒等［1］从分离自红树林植物内生真菌的杂色曲霉MA-229的发酵产物中得到9个化合物，分别对小麦全蚀病菌和小麦赤霉病菌有较好的抑制活性，并且还有抗虫活性；Yan等［4］从深海中分离到1株杂色曲霉，可产生具有抗氧化活性的胞外多糖体；巩婷等［6］从海洋真菌杂色曲霉F62中分离得到6个丁内酯类活性化合物，均表现出较强的抗炎活性。众多文献表明杂色曲霉（A. versicolor）生物活性物质非常丰富。

1980年，Alberts等［7］从 土 曲 霉（A. terreus）中提取到称为洛伐他汀（Lovastatin）的化合物。Lovastatin是降血脂的他汀类药物，主要作用机理是该分子酸式结构与羟甲基戊二酸辅酶A（HMG-CoA）相似，而HMG-CoA还原酶是合成胆固醇的限速酶，Lovastatin能选择性的与该限速酶结合，起到竞争性抑制作用，从而阻断胆固醇的合成来降低心血管疾病的病发［8-9］。目前，Lovastatin在食品和药品工业中已被广泛应用。微生物发酵工业中，影响产量的两个关键因素是生产菌种和发酵条件。因此，选育稳定高产Lovastatin的曲霉新菌种对并其发酵工艺进行优化，可为Lovastatin工业化生产提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 曲霉属菌株 从不同生境（食品、土壤、有机质等）收集的自然发酵样品，经分离筛选得到曲霉属纯菌株。

1.1.2 培养基 （1） PDA培养基（g/L）：马铃薯200、葡萄糖20、琼脂15、水、pH 5.5；用于曲霉菌株的分离纯化和鉴定。（2）PD培养液（g/L）：马铃薯200、葡萄糖20、水、pH 5.5；用于高产Lovastatin曲霉菌株的筛选和种子培养。（3）发酵培养液（g/L）：马铃薯200、葡萄糖20、牛肉膏5、水、pH 5.5；用于高产Lovastatin菌株的发酵培养。（4）碳源筛选基础培养基（g/L）：牛肉膏5、NaCl 2、KH2PO41、MgSO4·7 H2O 1、水、pH 5.5 ；用于碳源筛选。（5）氮源筛选基础培养基（g/L）：乳糖20、NaCl 2、KH2PO41、MgSO4·7 H2O 1、水、pH 5.5；用于氮源筛选。

1.2 方法

1.2.1 曲霉菌株的分离纯化 从不同生境收集的样品表面挑取少量菌丝接入PDA平板，28℃培养24 h，白色绒毛状菌丝长出后，取少许顶端菌丝转接于另一PDA平板上培养3 d，显微镜观察，挑取具有曲霉的典型特征少许顶端菌丝纯化3次，得性状均一的曲霉纯菌株。编号保存于25%甘油中，4℃备用。

1.2.2 产生洛伐他汀曲霉菌株的筛选

1.2.2.1 曲霉属各菌株的培养 保存的菌株在PDA平板上28℃活化培养3 d后，取1菌饼（直径8mm）接种于PD培养液中，28℃、180 r/min摇床培养2 d，制得种子液；按8%转接到发酵培养液中，28℃、180 r/min培养7 d，发酵液用于检测Lovastatin的产量，筛选高产曲霉菌株。

1.2.2.2 薄层层析法（Thin-layer chromatography，TLC）初筛 发酵液超声破壁30 min，取1.5 mL于离心管中，8 000 r/min离心10 min，取上清液500 μL加100 μL乙酸乙酯振荡萃取取上层液为待测样品，毛细吸管吸取1/4管样品点5次于硅胶板上；Lovastatin标准品为对照，乙酸乙酯作展开剂，展开至15 cm，晾干，紫外灯（波长254 nm）观察斑点并拍照。

1.2.2.3 高效液相法（High performance liquid chromatography，HPLC）复筛 取发酵液0.4 mL于2 mL离心管中，加入1.6 mL的甲醇，25 Hz超声波30 min，50℃水浴2 h，间歇振荡3-4次，8 000 r/min离心10 min，取上清液用0.45 µm有机膜过滤到另一2 mL离心管中，HPLC法测定滤液中的Lovastatin含量。HPLC检测的色谱条件：Agilent 5 TC-C18（250×4.6 mm）液相色谱柱；乙腈为色谱纯，磷酸为优级纯，水为超纯水，检测波长λ = 237 nm，柱温28℃，流速1 mL/min，进样量20 μL。Lovastatin标准曲线的绘制参照文献［10］。

1.2.3 目标菌株的鉴定 目标菌株在PDA平板上28℃培养7 d，显微镜观察其菌丝、分生孢子头、分生孢子梗、顶囊、分生孢子等的形态特征。提取目标菌株的基因组DNA，扩增rDNA ITS基因序列，送上海生物工程公司测序。根据形态特征和rDNA ITS基因序列，参考曲霉属《The GenusAspergillus》分种检索表确定所目标菌株属种。

1.2.4 培养基配方及摇瓶发酵条件优化 用单因素实验优化培养基配方（碳源种类、氮源种类、碳源含量、氮源含量、碳氮比C/N）和发酵条件（温度、初始pH、摇床转速、接种量），实验设3次平行重复。数据用SPSS软件数据统计，Dunan’s多重检验进行均值比较，显著性水平设为P≤0.05。

2 结果

2.1 不同生境分离纯化曲霉菌株的形态特征

经分离纯化获得86株曲霉纯菌株。不同曲霉菌株的菌落形态有较大差异（图1）；分生孢子头、分生孢子梗、顶囊、分生孢子等显微形态特征也各不相同（图2），表明来源于不同生境的曲霉菌株具有丰富的多样性。

图1 5株代表性曲霉菌株的菌落形态

图2 5株代表性曲霉菌株的分生孢子头显微形态

2.2 产生Lovastatin曲霉菌株TLC法初筛结果

通过TLC法初步筛选得到36株产Lovastatin的曲霉菌株。如图3所示，不同曲霉菌株产生Lovastatin产量不同，有些菌株发酵液与标准品相同位置条带明显，表明该菌株产生Lovastatin含量较高；有些菌株在该位置条带不明显或没有，表明该菌株产生Lovastatin能力较弱或不产生。选取Lovastatin条带较明显的菌株进行HPLC法定量检测复筛。

图3 Lovastatin标准品和曲霉菌株发酵液TLC法初筛结果

2.3 产生Lovastatin曲霉菌株的HPLC法复筛结果

用HPLC法复筛结果（图4）表明不同曲霉菌株Lovastatin产量存在显著差异。Lovastatin产量大部分分布在10-25 μg/mL之间（34株），25-58 μg/mL范围内有2株曲霉菌株。经进一步筛选确证8号曲霉菌株Lovastatin产量最高，为58 μg/mL，并将其编号为A-8。

图4 Lovastatin标准品和8号曲霉发酵液HPLC检测结果

2.4 A-8曲霉菌株的鉴定结果

2.4.1 菌落形态和显微形态 PDA培养基上的菌落初期为白色绒毛状或絮状，后变成灰绿色，边缘白色，7 d菌落直径可达50 mm；显微镜观察菌丝光滑，有隔膜，分支状；分生孢子头初为球形，后呈放射形，顶囊呈半椭圆形至半球形；上半部或3/4部位着生小梗，小梗双层，分生孢子呈淡绿色，球形或近球形，粗糙，直径（4-5）μm×（4-4.5）μm（图5）。

图5 Av-8曲霉菌株PDA上培养7 d菌落（A）、分生孢子头（B、C）和分生孢子（D）

2.4.2 rDNA ITS基因序列 A-8曲霉菌株ITS基因序列如图6，长度为545 bp；系统发育树（图7）分析表明：与杂色曲霉亲缘关系最近，达99%。根据A-8曲霉菌株的菌落和显微形态特征和rDNA ITS基因序列，结合曲霉属分种检索表，鉴定8号菌株为杂色曲霉。

2.5 发酵条件的优化

发酵条件的优化结果见表1。在24-34℃温度范围内，最适发酵温度为28℃；在最适温度的基础上，初始pH以 5.2最为适宜；在适宜温度和初始pH的基础上，摇床转速以180 r/min为宜；在适宜的培养温度、pH和摇床转速的基础上，接种量以10%为宜。

2.6 培养基配方的优化

2.6.1 碳源和氮源种类的筛选 碳源和氮源种类的筛选结果见表2，乳糖为较适宜的碳源，蛋白胨为较适宜的氮源。

2.6.2 乳糖和蛋白胨含量对Lovastatin产量的影响 乳糖和蛋白胨含量对Lovastatin产量的影响结果见表3。以乳糖为适宜碳源，在70-120 g/L乳糖含量范围内设置6个梯度；当乳糖含量为100 g/L时，Lovastatin达到最大值为84.33 μg/mL。以蛋白胨为适宜氮源，在4-14 g/L蛋白胨含量范围内设置6个梯度；当蛋白胨为12 g/L时，Lovastatin达到最大值为 87.01 μg/mL。

图6 A-8曲霉菌株ITS rDNA基因序列（545 bp）

图7 基于12株曲霉属ITS rDNA基因序列建立的A-8菌株系统发育树

2.6.3 碳氮比对Lovastatin产量的影响 碳氮比对Lovastatin产量的影响结果见表4。以乳糖为碳源，蛋白胨为氮源，在碳氮比5/0.5-15/2.25范围内设置10个梯度；当碳氮比为15/1.5时，Lovastatin达到最大值为 130.04 μg/mL。

3 讨论

Alberts等［7，11］报道，红曲霉及其它一些丝状真菌如木霉属（Trichoderma）、青霉属（Penicillium）、曲霉属（Aspergillus）等都会产Lovastatin。其中曲霉属真菌报道最多，主要种类有费舍尔曲霉（A.fischeri）［12］、黄曲霉（A. flavus）［13］、黄柄曲霉（A.flavipes）［13］、黑曲霉（A. niger）［13］、寄生曲霉（A.parasiticus）［13］，土曲霉（A. terreus）［14］等。目前Lovastatin的主要工业生产菌种国外为土曲霉（A.terreus）、国内为红曲霉（Monascus）。

表1 发酵条件对曲霉A-8菌株产Lovastatin的影响

表2 不同碳源和氮源对曲霉A-8菌株产Lovastatin的影响

表3 不同乳糖和蛋白胨含量对曲霉A-8菌株产Lovastatin的影响

表4 碳氮比对曲霉A-8菌株产Lovastatin的影响

已报道的部分曲霉菌株Lovastatin的产量比较见表5。Javed等报道［13］，用黄曲霉（A. flavusGCBL-60）发酵菌种，米糠为主要原料，在35℃、pH 5.5等条件下，液体发酵96 h，Lovastatin产量约为28.36 ± 0.76 mg/100 mL。刘爱英等［15］用紫外诱变处理1株紫色红曲霉（M. purpureusZZ），诱变后摇瓶发酵该菌株Lovastatin产量为219.9 μg/mL。童振宇等［16］对1株紫色红曲霉（M. purpureusWX）液态发酵培养基进行了优化，Lovastatin产量达到了297.4 μg/mL。游玟娟等［17］采用 Box-Behnken 设计对1株红曲霉高产突变株（Monascussp. UV-D-9）发酵生产Lovastatin条件进行了响应面优化，得到适宜发酵条件为：发酵温度 30.4℃，装液量为134mL，转速187 r/min，发酵时间 10 d，接种量8%；Lovastatin产量约为320 mg/L；章婷等［18］筛选到1株产生洛伐他汀棒曲霉（A. clavatus），经响应面优化 Lovastatin产量约为 236 μg/mL；Hasan等［19］通过基因工程手段过表达乙酰辅酶 A 羧化酶（acetyl-CoA carboxylase），使土曲霉（A. terreus）Lovastatin产量提高了40%；Fu等［20］筛选到1株产生洛伐他汀类似物的杂色曲霉（A. versicolorSC0156）。而利用杂色曲霉发酵产生Lovastatin国内外尚未见有报道，本实验室筛选的曲霉菌株A-8，经培养基配方和培养条件初步优化，Lovastatin产量达130 μg/mL左右；通过理化诱变或基因工程改良，Lovastatin产量可进一步提高，本实验丰富了生产Lovastatin的菌种资源，所选的杂色曲霉菌株具有良好的应用前景。

4 结论

本实验结果表明，来源于不同生境（食品、土壤、空气和有机质等）的曲霉菌株在菌落形态、显微形态和代谢产物产生上具有丰富的多样性。经筛选获得1株高产Lovastatin曲霉A-8菌株；经鉴定A-8菌株为杂色曲霉（A. versicolor）。经单因素实验初步优化发酵条件和培养基配方，A-8曲霉菌株发酵产生Lovastatin的水平可达130.04 μg/mL，A-8曲霉菌株是较有潜力的工业菌株。

表5 已报道的部分曲霉菌株Lovastatin的产量比较