儿童特应性皮炎患者肠道菌群中益生菌的构成比研究

罗瑞静 王英杰 刘 杰 彭 勇 武宗琴 姜珠倩 李 淑 柴维汉

特应性皮炎(atopic dermatitis，AD)是皮肤科常见病，多发病，近年来由于其发病率在世界范围内逐年升高，给家庭和社会带来严重经济负担[1]。该病起始于婴幼儿期，历经儿童期，最终发展成为成人特应性皮炎，严重影响患者生活质量。其发病机制目前尚未完全阐明，已有研究表明肠道菌群中益生菌数量的减少参与该病的发生及发展，且应用益生菌治疗该病确有良效[2，3]。因此，积极阐明其发病机制，有利于临床治疗，本实验即探讨儿童特应性皮炎患者肠道菌群中益生菌的变化情况。

1 资料与方法

1.1 一般资料 符合纳入标准的35例6～12岁特应性皮炎患者均为2015年4月至2017年4月在上海市嘉定区中医医院皮肤科门诊就诊患者，另外27名6～12岁健康对照组儿童来自上海市嘉定区城中路小学和普通小学。本研究获得医院医学伦理委员会的批准，研究对象及家长或监护人均知情同意。

1.2 纳入标准 AD组纳入标准：(1)符合Williams[4]诊断AD标准者；(2)6～12岁儿童；(3)无其他皮肤疾病；(4)无心、肝、肾等各系统严重异常；(5)无精神疾病、残疾、智力障碍；(6)近2个月未内服过糖皮质激素或近2周内未外用过此类药品；(7)近2周未患腹泻等肠道疾病及近2周未服用含益生菌等微生物制剂；(8)近2周没有使用抗生素。Normal组纳入标准：AD组纳入标准(1)除外，还需无过敏性鼻炎、哮喘等过敏性疾病史。

1.3 样本采集 将粪便放于粪便收集盒中，要求避免尿液、灰尘等污染，选取无污染的部分，粪便标本量大于1 g。标本采集后标记姓名，并进行编号，标记后存储于-20℃冰箱，干冰运送至上海美吉生物医药科技有限公司进行检测。

1.4 样本检测

1.4.1 实验试剂及仪器

1.4.1.1 实验试剂 见表1

1.4.1.2 实验仪器 见表2

表1 实验所用试剂、型号、公司及国家

表2 实验所用仪器、型号、公司及国家

1.4.2 DNA提取及PCR扩增 根据E.Z.N.A.® soil试剂盒(Omega Bio-tek,Norcross, GA, U.S.)说明书进行总DNA抽提，DNA浓度和纯度利用NanoDrop2000进行检测，利用1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA提取质量；用338F(5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’)和806R(5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’)引物对V3-V4可变区进行PCR扩增。

1.4.3 Illumina MiSeq测序及分析 应用上海美吉生物医药科技有限公司Illumina MiSeq测序平台对研究对象治疗前后粪便细菌的16SrRNA基因V3～V4区进行高通量测序及分析。

1.5 统计学方法 生物学统计及分析由上海美吉生物医药科技有限公司i-sanger平台提供。

2 结果

2.1 样本信息统计 将测序所得原始序列去杂处理后，62个样本共获得 2269944条优化序列可供后续分析，平均长度435.96 bp，其中99.95%序列长度集中在400～500 bp，基本覆盖了16SrDNA V3+V4双高变区的全长。对所有样本进行抽平后物种筛选，共获得Domain:1个；Kingdom:1个；Phylum:16个；Class:30个；Order:48个；Family:82个；Genus:230个；Species:427个；OTU:569个。

2.2 群落组成分析(Community composition analysis) 在不同分类学水平上统计各样本的物种丰度，通过(图1)来直观研究群落组成。

通过AD组与N组样本微生物属水平群落组成分析可以看出：Heatmap图展示的10个属，来自于4个菌门，结果表明AD组样本中物种丰度总体低于N组样本。

注：热图下侧和右侧分别为样本名称和OTU编号(或者物种名称)，如果进行了聚类分析左侧和上侧分别为物种聚类树和样本聚类树。热图中颜色的深浅分别代表OTU(或者物种)丰度的高低。

2.3 物种差异分析 组间差异显著性检验根据得到的群落丰度数据，运用统计学方法可以检测不同组(样本)微生物群落中表现出的丰富度差异的物种，进行假设性检验，评估观察到的差异的显著性。本实验选择属、种水平双歧杆菌与乳酸杆菌已知物种进行秩和检验分析。

通过比较可以看出：在属水平，AD组患者双歧杆菌属物种丰度较N组升高，而乳酸杆菌属物种丰度较N组降低(表3)；在种水平，AD组患者双歧杆菌属下Bifidobacterium_pseudocatenulatum_DSM_20438__JCM_1200__LMG_10505、unclassified_g__Bifidobacterium、Bifidobacterium_adolescentis、Bifidobacterium_animalis物种丰度较N组升高，而Bifidobacterium_breve物种丰度降低，差异均无统计学意义(P>0.05)。AD组乳酸杆菌属下Lactobacillus_salivarius 物种丰度较N组降低，但差异无统计学意义(P>0.05)，而unclassified_g__Lactobacillus、Lactobacillus_plantarum_subsp._plantarum物种丰度升高，且unclassified_g__Lactobacillus物种丰度升高差异有统计学意义(P<0.05)(表4)。

表3 AD组与N组益生菌在属水平差异比较一览表

注：P>0.05

表4 AD组与N组益生菌在种水平差异比较一览表

注：*P<0.05

3 讨论

特应性皮炎是一种慢性、瘙痒性、过敏性、炎症性皮肤病，其发病机制复杂，已有研究证实，免疫异常是其发病的关键环节，其中Th1/Th2分化失衡引起细胞因子分泌异常在AD发生发展中发挥重要作用[5]。但其具体发病机制并未完全阐明，近来，益生菌的缺乏参与特应性皮炎的发生及发展正逐步为大家所认识[6]，并成为研究热点。

肠道微生态系统是人体微生态系统的重要组成部分，肠道微生物与机体相互作用，保持动态平衡，共同维护机体生理功能正常发挥，当这种动态平衡被打破，影响到机体生理功能正常发挥时，疾病就会发生[7]。其中益生菌是肠道菌群的重要组成部分之一,世界卫生组织(WHO)定义“益生菌为活的微生物，补充适当的数量对宿主产生益处”，临床上广泛使用的益生菌主要是双歧杆菌、乳酸杆菌[8，9]。本次实验即通过高通量测序技术通过检测两组患者粪便中双歧杆菌、乳酸杆菌两属下种的变化情况，来探讨AD患者肠道菌群中益生菌的变化情况。

虽然益生菌干预/治疗AD的研究相对较多，对缓解AD病情有一定帮助，但Meta分析显示，二者之间并无明显差异，因此也有待进一步确定[10]。但是肠道益生菌通过调节机体免疫系统参与以及治疗过敏性疾病的研究已相对较为明确[6]。目前而言尚缺乏特应性皮炎患者与正常人肠道菌群或益生菌差异的直接比对研究。本研究通过高通量测序检测比较发现：在属水平，AD组患者双歧杆菌属物种丰度较N组升高，而乳酸杆菌属物种丰度较N组降低；在种水平，AD组患者双歧杆菌属下Bifidobacterium_pseudocatenulatum_DSM_20438__JCM_1200__LMG_10505、unclassified_g__Bifidobacterium、Bifidobacterium_adolescentis、Bifidobacterium_animalis物种丰度较N组升高，而Bifidobacterium_breve物种丰度降低，差异均无统计学意义(P>0.05)。AD组乳酸杆菌属下Lactobacillus_salivarius物种丰度较N组降低，但差异无统计学意义(P>0.05)，而unclassified_g__Lactobacillus、Lactobacillus_plantarum_subsp._plantarum物种丰度升高，且unclassified_g__Lactobacillus物种丰度升高差异有统计学意义(P<0.05)。

Munyaka等[11]通过比较患有特应性疾病和非特应性疾病婴儿的肠道菌群，发现二者具有显著差异,非特应性疾病婴儿肠道中含有更多的双歧杆菌和乳酸杆菌，而特应性疾病婴儿肠道中却含有较多的梭状芽孢杆菌。本研究并未发现AD患者肠道益生菌较正常人明显降低，虽然存在一定差异，但该差异与已有研究报道并不完全一致，可能与实验设计中研究对象、病程、检测方法等因素相关，今后应深入研究。