槲皮素和原花青素对豚鼠白癜风模型黑素合成的影响

周梦圆 徐丽娟 谭 城 闵仲生

槲皮素学名为栎精、槲皮黄素，是一种属于黄酮类的天然有机化合物，由于其具有较强的抗氧化功效而在医学上得到应用，主要存在于菟丝子以及桑寄生、红花等中药中，是主要活性成分之一。原花青素亦具有天然抗氧化物的成分，一般在银杏以及葡萄中具有较高的含量。临床中，上述药物常用于白癜风的治疗，而目前对于抗氧化作用治疗白癜风的研究及应用较少。因此，结合槲皮素、原花青素的功效，我们设计了白癜风豚鼠模型的实验，旨在分析通过其对治疗前后皮损复色及对黑素颗粒、黑素小体的影响，探求其治疗白癜风的发病机制，为白癜风的治疗开辟途径。

1 材料及动物

1.1 实验试剂与动物 在90%的医用乙醇中放入槲皮素或者原花青素母液(由南京泽朗生物科技有限公司提供)，配制成10 mg/mL的溶液，在-20℃的环境中进行保存。参照文献[1，2]，临用时调至为终极浓度为0.5%槲皮素，0.1%、0.3%原花青素。其中实验中采用的8-甲氧补骨脂素酊剂由中国医学科学院皮肤病医院所提供。

为使实验具有可观察性[3]，选用健康褐色、杂色豚鼠共计38只(江苏省中医药动物实验中心提供，普通级)。其中，雌鼠18只，雄鼠20只，体重为300～500 g。首选把每只豚鼠背部进行脱毛处理，为方便观察，脱毛面积约为4 cm×4 cm，每次均匀涂抹1 mL的5%过氧化氢溶液[4]，时间为每日2次，每次2～3分钟，直至豚鼠毛色、皮肤变白。

1.2 分组 对豚鼠按体重划分A～F组共6组，A组为标准对照组，外用90%乙醇对豚鼠背部进行处理；B组为空白对照组，采用蒸馏水；C组为阳性对照组，外用0.1%的8-MOP(每次涂药后需进行日光照射，时间为10 min)；D组外用0.5%槲皮素酊剂；E组为外用0.1%原花青素酊剂；F组外用0.3%原花青素酊剂。每次涂药1 mL，每天2次，连用40天后取皮损病理切片，观察黑素合成情况。

2 实验方法

2.1 皮肤颜色变化观察 在试验的过程中，设置固定的皮肤颜色观察时间来查看每个试验组的黑素沉着现象，2周一次进行拍照统计。色素复色的评分标准[5]：0分为苍白或白斑或无变化；1分为淡褐色或色素面积恢复<50%；2分为中褐色或浅灰色或色素面积恢复>50%；3分为深褐色或黑素或色素基本恢复正常。若色素复色介于不同分数之间，则取平均值。

2.2 皮肤组织学变化 以HE染色观察。

2.3 黑素合成情况 ①基于Fontana-Masson法[6]观察黑色颗粒的变化情况：选取常规石蜡切片，放入配好的氢氧化氨银溶液内，置于37℃暗处孵育，时间为2 h，然后采用标注的V、G液对比并进一步染色处理，染色2 min，最后以浓度为95%的乙醇、无水乙酸脱水，以二甲苯透明，以中性树胶封片，观察到的黑素颗粒为黑色；②采用电镜观察黑素小体分布及数目的变化。

2.4 统计学方法 本次实验采用SPSS 17.0对实验测试数据进行采集与分析，在处理的过程中，针对离散的数据建立秩和检验模型，针对正态分布的数据采用方差法进行分析，其次，每组数据之间采用Wilcoxon秩和检验，多组数据之间采用Friedman秩和检验的算法进行比较分析。

3 结果

在实验期间，豚鼠背部无红斑、鳞屑、破溃、水疱等不良的反应，38只豚鼠在实验治疗期间无死亡个例。

3.1 肉眼观察色素积分 色素积分统计结果显示如下：分别于治疗2周、4周、40天的前后，比较C、D、F三组，色素积分存在显著差异(秩和检验P<0.01)；C、D、F组之间的比较表明，三组色素积分为处理40天>4周>2周，随着治疗时间的延长，三种不同的处理方法对皮损复色的影响逐渐增大。治疗2周、4周、40天前后，A、B、E组之间无统计学差异(表1)。

3.2 皮肤组织学变化 HE染色光镜下观察结果显示，经过治疗后的豚鼠表皮厚度与正常豚鼠表皮厚度没有产生明显差别，其中，采用A组与B组处理后的豚鼠表皮厚度较薄，C、D、E、F组处理后的豚鼠表皮厚度与正常豚鼠表皮厚度无明显差异，其中D组处理后的豚鼠表皮厚度最接近正常豚鼠的表皮厚度。

经过实验观察，豚鼠实验对照组的前后豚鼠细胞比较完整，在色素颜色方面，A、B组在治疗后的基底层色素比C、D、F组有所增加，而且C、D、F组的实验前后的色素也有所差异，实验后色素都存在一定的增加。

表1 2周、4周、40天后的各组色素积分比较

注:*P<0.01，不同的处理天数比较差异有统计学意义

表2 Fontana-Masson法观察黑色颗粒的变化情况

注：Fontana-Masson法结果显示，与A、B组相比，其余4组黑素颗粒明显增多，其中A、B组之间无明显差异(均P<0.05)，D、F组明显多于E组(均P<0.05)

3.3 黑素合成情况 在电镜下观察发现，在黑素小体的数量方面，0.1%原花青素组的黑素小体数量较少，且在观察区域内黑素小体分布较分散；在实验组内，槲皮素组的黑素小体的数量最多，然后是0.3%原花青素组，最后是0.1%原花青素组，可以看出原花青素的浓度大小对黑素小体的数量具有一定的影响(表2)。

4 讨论

目前，白癜风的病因与黑素细胞凋亡的原因尚无定论，但在理论研究方面认为其发病机制主要来源于自身免疫、黑素细胞自毁、神经化学、微量元素、遗传因素、微循环等方面。其中白癜风的发病机制与氧化应激密切相关。氧化应激是细胞过度产生或不充分清除活性氧分子的结果，导致机体氧化-抗氧化平衡受损，并可能导致蛋白质、脂质和核酸等不同生物大分子的非特异性损伤[7]。表皮内氧化应激作用于机体，具体表现在打破钙稳态平衡、影响黑素的合成、过氧化氢的聚集以及遗传等方面，从而导致白癜风的发生[8]。黑素细胞在通过外界紫外线的照射后，易产生大量的自由基而致细胞毒作用，在一定程度上加速黑素细胞的死亡。白癜风患者的外周血自由基代谢相关酶存在异常，故如何加速皮损内自由基清除是白癜风治疗中主要难点之一。伪过氧化氢酶能够恢复皮损处过氧化氢酶的活性，改善白癜风皮损的局部高氧化应激状态，临床中取得了一定的疗效，但近年来也研究表明该药物仍不甚理想。

植物药及其中活性产物是天然、高效抗氧化剂。芹黄素[9，10]、黄芩素[11]等黄酮类化合物是天然的植物抗氧化剂，可减轻氧化应激所致黑素细胞损伤。槲皮素亦是一种黄酮类化合物，但目前关于其的相关研究甚少。原花青素药效广泛，对其研究和开发已有几十年的历史，但当前对其生理功能活性相关的分子结构、信号通路以及酶的认识仍尚不确切[12]。国内外对天然抗氧化剂的迫切要求，使得进一步研究槲皮素、原花青素势在必行。

皮肤化学脱色法主要包括两种，一为氢醒，二为过氧化氢，前者为酪氨酸酶抑制剂，抑制酪氨酸酶，影响黑素生成；后者为强效的氧化剂，漂白的主要成分为HO2-。龙子江等[13]使用5%过氧化氢对豚鼠脱色后发现：表皮基底层及棘层黑素、毛囊黑素明显减少, 效果与用药时间呈正比，说明过氧化氢具有模拟白癜风的作用。张兰兰等[14]运用二者对豚鼠脱色后，豚鼠细胞内的酪氨酸酶及黑素细胞、颗粒等都发生了变化，基底细胞数量减小的同时相应酶的活性也低于常态，因此该理论的研究具有模拟白癜风发病的作用。而诸多研究亦[15-17]表明，细胞损伤与细胞内的自由基的数量存在一定的联系，白癜风患者表皮中过氧化氢的沉积致使氧化应激的状态，直间接地损伤黑素细胞，而出现白斑。

经治疗后的豚鼠表皮厚度与空白对照组没有明显变化，外用的中药制剂对白癜风模型鼠皮肤进行复色，复色的区域未发生明显的炎细胞浸润现象，而许多外用西药一般都含有糖皮质激素，有很大几率会造成局部皮肤出现萎缩、变薄等不可逆的副作用。

实验结果表明在治疗白癜风时采用本实验中的中药治疗方案，具有一定的效果，且通过电镜观察处理组的细胞，可以发现经过处理的皮肤区域内的毛囊周围均观察到黑素细胞的聚集，这也证实经过处理后皮肤出现复色效果，说明白癜风的复色过程主要是通过激活皮损内毛囊外毛根鞘存在的无功能性黑素细胞，激活后的黑素细胞进行分裂增殖并沿毛囊外毛根鞘上移进入表皮而完成。

实验结果表明原花青素以及槲皮素均可以使棕色豚鼠皮肤黑素小体分布密度及数量增加，其中槲皮素组的实验结果最为显著，其次为0.3%原花青素。然而由于在电镜下观察到的样本量很小，而且本次实验中的实验体数量有限，而且样本具有一定的随机性，实验对比结果并不能代表全部情况，仅作为参考指标。